Séquençage RNA-Seq Direct par Nanopore : Dévoiler l'Abondance et les Modifications des tRNA

ARNt

ARNtLes ARN non codants cruciaux, abondants dans les cellules, occupent une position centrale dans le processus complexe de la traduction des protéines. Ces molécules agissent comme des connecteurs entre l'ARN et les codons protéiques. Notamment, les ARNt subissent d'importantes modifications, avec une moyenne de 13 altérations par molécule d'ARNt. Bien que certaines modifications soient structurelles et stables, d'autres présentent des caractéristiques dynamiques et réversibles, influençant de manière significative le destin et la fonction des entités d'ARNt individuelles.

Les mutations dans les enzymes modifiant l'ARNt ont été liées à un large éventail de maladies humaines, soulignant leur importance dans le fonctionnement cellulaire normal. Malgré leur signification, il existe un écart notable dans notre capacité à quantifier systématiquement et avec précision les deux. l'abondance des ARNt et leurs modificationsUne méthode rationalisée, robuste et efficace pour séquencer les tARN fait actuellement défaut, entravant notre compréhension globale de ces molécules essentielles et de leurs rôles dans les processus cellulaires.

Nano-tRNAseq

Récemment, des chercheurs ont introduit le Nano-tRNAseq, une révolutionnaire méthode basée sur les nanopores conçu pour le séquençage des tARN naturels. Cette approche innovante permet non seulement de quantifier avec précision l'abondance des tARN, mais aussi de capturer les modifications, offrant un cadre solide pour explorer le tARNome au niveau de la molécule unique.

Le Nano-tRNAseq peut séquencer efficacement à la fois les populations de tRNA IVT et natifs. (Lucas et al., 2023)

Pour améliorer la récupération des lectures de tRNA, les chercheurs ont systématiquement reprocessé les signaux d'intensité de courant bruts des nanopores, ce qui a entraîné une augmentation remarquable de 12 fois du nombre de lectures obtenues avec succès. Cette optimisation méticuleuse a permis la reproduction fidèle de mesures précises de l'abondance des tRNA. Par la suite, le Nano-tRNAseq a été appliqué pour examiner la population de tRNA de Saccharomyces cerevisiae, révélant des interactions complexes et une interdépendance entre différents types de modifications de tRNA au sein de la même molécule. De plus, la méthode a mis en lumière des changements dynamiques dans la population de tRNA en réponse au stress oxydatif.

Remarquable par sa simplicité, son rapport coût-efficacité, son débit élevé et sa reproductibilité, le Nano-tRNAseq émerge comme un outil puissant pour investigation des modifications de l'ARNt à travers divers contextes biologiques. Sa polyvalence le rend particulièrement précieux pour étudier les implications biologiques des modifications de l'ARNt dans des scénarios variés tels que le cancer, l'exposition au stress ou les infections virales. Cette avancée ouvre des possibilités passionnantes pour utiliser les molécules d'ARNt comme biomarqueurs potentiels pour surveiller la santé humaine et les maladies.

Nano-tRNAseq avec MinKNOW personnalisé

Les chercheurs ont stratégiquement utilisé des adaptateurs d'ARN pour peupler à la fois les extrémités 5' et 3' des molécules d'ARNt, optimisant ainsi la précision de l'appel de bases et du mapping pour capturer des séquences complètes d'ARNt. Le Nano-tRNAseq a montré un succès exceptionnel en utilisant le séquençage d'ARN direct (DRS) par nanopore pour le séquençage, l'appel de bases et le mapping complets des molécules d'ARNt in vitro et naturelles.

L'ajustement des paramètres MinKNOW augmente le nombre de lectures de tRNA séquencées et mappées. (Lucas et al., 2023)

L'utilisation de molécules d'ARNt linéaires s'avère essentielle pour atténuer le colmatage des pores, améliorer la capacité de séquençage, prolonger l'intégrité du pool de passage et stabiliser le taux de translocation de l'ARNt à travers le pore. Cela, à son tour, affine la précision de l'algorithme de détermination des bases. Notamment, les chercheurs ont identifié que la combinaison de 60°C Maxima et de SuperScript IV offrait des performances optimales pour la génération de produits d'ADNc de pleine longueur, les conduisant à adopter 60°C Maxima pour les expériences de séquençage d'ARNt ultérieures.

La nouvelle méthodologie introduite dans cette étude, Nano-tRNAseq, facilite la quantification précise et directe de l'abondance moléculaire des tRNA naturels et de leur état de modification en utilisant le DRS par nanopore. Les chercheurs ont découvert que s'appuyer uniquement sur la double ligation des adaptateurs d'ARN était insuffisant pour généraliser les abondances connues des tRNA. De plus, la configuration par défaut de MinKNOW présentait des abondances de tRNA biaisées, favorisant les molécules de tRNA plus longues. Pour relever ces défis, l'étude a mis en œuvre une configuration MinKNOW personnalisée, qui non seulement capture les lectures de tRNA plus efficacement, mais élimine également le biais dépendant de la longueur, entraînant une augmentation remarquable de 12 fois du débit de séquençage des tRNA.

Référence :

1. Lucas, M.C., Pryszcz, L.P., Medina, R. et al. Analyse quantitative de l'abondance et des modifications des tRNA par séquençage RNA nanopore. Nat Biotechnol (2023).