Favoriser l'hétérogénéité tumorale : L'impact de l'ADN extracromosomique cyclique (ecDNA)

Qu'est-ce que l'ADN extracromosomique cyclique (ecDNA) ?

Depuis les années 1960, la présence d'ADN extrachromosomique cyclique (ecDNA) a été documentée dans des tumeurs isolées et des cellules dérivées de tumeurs. Caractérisé comme un corps de chromatine circulaire et non filamenté avec des longueurs variables allant de dizaines de kilobases à des dizaines de mégabases (Mbp), ecDNA cyclique émerge comme un facteur clé contribuant à l'hétérogénéité intra-tumorale. Son implication dans la tumorigenèse, l'évolution tumorale et le développement de la résistance aux médicaments souligne son importance.

ecDNA cyclique et cancer

L'ecDNA cyclique joue un rôle important en tant que forme répandue d'amplification d'oncogène à haute copie, servant de biomarqueur pronostique dans divers types de tumeurs. Notamment, le médulloblastome a été particulièrement mis en avant dans les premiers rapports de cas détaillant ecADNMalheureusement, le paysage thérapeutique actuel pour le médulloblastome manque de thérapies moléculaires ciblées hautement efficaces. Le traitement standard actuel comporte des risques substantiels, notamment des troubles cognitifs, des dommages neurologiques et le potentiel de malignités secondaires.

Le médulloblastome est stratifié en quatre grands sous-groupes moléculaires : WNT, SHH, type 3 et type 4. Sur le plan pronostique, les tumeurs avec activation de MYC dans le type 3 et celles avec mutations de TP53 dans les sous-types SHH présentent des résultats particulièrement sombres. Cela souligne l'urgence de développer des approches thérapeutiques innovantes pour la gestion du médulloblastome, compte tenu des défis associés aux modalités de traitement actuelles et de la gravité du pronostic au sein de certains sous-groupes moléculaires.

l'ecDNA exacerbe l'impact oncogénique dans le médulloblastome

Dans l'enquête, 102 instances de séquences d'ADN extrachromosomique (ecDNA) ont été identifiées dans des échantillons de tumeurs obtenus auprès de 82 individus, représentant 18 % des 468 patients étudiés. Les tumeurs avec positivité ecDNA (ecDNA+) étaient réparties parmi les patients comme suit : WNT, 0 sur 22 au total ; SHH, 30 sur 112 (27 %) ; type 3, 19 sur 107 (18 %) ; et type 4, 26 sur 181 (14 %). Fait remarquable, les tumeurs du sous-groupe SHH présentaient une probabilité plus élevée de contenir de l'ecDNA par rapport aux autres sous-groupes de médulloblastome.

Dans cette cohorte, les gènes amplifiés par ecDNA observés dans deux échantillons ou plus comprenaient des oncogènes de médulloblastome bien établis ou suspectés, notamment MYC, MYCN, MYCL, TERT, GLI2, CCND2, PPM1D (WIP1) et ACVR2B. De plus, des gènes associés aux mécanismes de réparation de l'ADN (RAD51AP1 et RAD21) et ceux codant des inhibiteurs de la voie TP53 (PPM1D28 et CDK6) figuraient parmi les candidats amplifiés par ecDNA identifiés. Ces résultats éclairent la complexité paysage génétique du médulloblastomeen mettant l'accent sur les implications thérapeutiques potentielles associées aux oncogènes amplifiés par l'ecDNA dans cette malignité.

Le paysage de l'ecDNA dans les tumeurs des patients atteints de médulloblastome. (Chapman et al., 2023)

ecADN comme indicateur de pronostic défavorable dans le médulloblastome

Les patients portant des tumeurs avec ADN extrachromosomique (ecDNA) exhibé une survie globale à cinq ans et une survie sans progression significativement diminuées par rapport à ceux ayant des tumeurs négatives pour l'ecDNA (ecDNA-). Notamment, la survie globale était nettement plus faible chez les patients ayant des tumeurs ecDNA+ au sein des sous-groupes SHH, type 3 et type 4 (P < 0,05). Pour évaluer davantage la signification pronostique de l'ecDNA, une analyse de régression des risques proportionnels de Cox a été réalisée, révélant que les individus ayant des tumeurs ecDNA+ faisaient face à un risque pronostique accru et à une mortalité augmentée par rapport à leurs homologues ayant des tumeurs ecDNA- (P < 0,005). Ces résultats soulignent le potentiel de l'ecDNA en tant que marqueur pronostique robuste dans le médulloblastome, mettant en évidence son association avec des résultats cliniques moins favorables.

Association des mutations de TP53 avec l'ecDNA dans le médulloblastome SHH

La protéine suppresseur de tumeur p53, codée par TP53, joue un rôle clé dans la régulation de la perception des dommages à l'ADN, de l'arrêt du cycle cellulaire et de l'apoptose, rencontrant fréquemment mutations somatiques et variants germinaux pathogènes dans le médulloblastome SHH. Pour explorer le lien potentiel entre les mutations de TP53 et la présence d'ADN extrachromosomique (ecDNA), les chercheurs ont examiné le statut des mutations somatiques et germinales de TP53 dans 92 cas de médulloblastome SHH.

Notamment, les mutations de TP53 étaient plus fréquentes dans les tumeurs SHH ecDNA+ par rapport à leurs homologues SHH ecDNA-. Cependant, cette corrélation n'était pas évidente dans d'autres sous-types de médulloblastome ou dans l'ensemble de la cohorte, suggérant une relation fonctionnelle spécifique au sous-type entre les mutations de TP53 et l'ecDNA, en particulier au sein du sous-type SHH. L'analyse de régression de Cox a révélé que l'impact de l'ecDNA sur la survie ne pouvait pas être attribué uniquement aux mutations de TP53. Bien que la causalité ne puisse pas être définitivement déduite de ces données seules, ces analyses mettent en évidence les mutations de TP53 et l'ecDNA comme des biomarqueurs cliniquement pertinents pour les tumeurs de médulloblastome SHH hautement agressives.

Coexistence de profils ecDNA divers dans des médulloblastomes sélectionnés

L'analyse de 16 cas de médulloblastome a révélé la présence de plusieurs distincts. séquences d'ADN extrachromosomique (ecDNA)Notamment, une tumeur médulloblastome SHH primaire présentant une mutation hétérozygote de TP53 (RCMB56-ht) a été sélectionnée pour l'établissement d'un modèle de xénogreffe orthotopique dérivé d'un patient (RCMB56-pdx). En profondeur séquençage du génome entier (SGE) et le mapping génomique optique (OGM) ont été utilisés pour l'assemblage du génome, confirmant l'existence d'un amplicon circulaire (amp1) comprenant trois fragments d'ADN sur le chromosome 1. De plus, un amplicon chromatiné continu (amp2) composé de 21 fragments sur les chromosomes 7 et 17 a été validé.

Pour déterminer la co-occurrence de ces profils distincts d'ecDNA au sein des mêmes cellules, une imagerie par hybridation in situ par fluorescence multicanal (FISH) des mêmes marqueurs dans des cellules en interphase a été réalisée. La présence de différents points fluorescents pour chaque gène dans le noyau de la même cellule indiquait que chaque copie du gène amplifié se trouvait sur un corps chromatinien séparé. Ces résultats soulignent la nature complexe de la diversité de l'ecDNA au sein des médulloblastomes, fournissant des informations précieuses sur le paysage génomique complexe de ces tumeurs.

Des amplifications extrachromosomiques distinctes à forte copie coexistent dans une tumeur de médulloblastome SHH. (Chapman et al., 2023)

Hétérogénéité des nombres de copies d'ecDNA dans les médulloblastomes

Dans cette enquête, les chercheurs ont établi un pipeline d'analyse d'image automatisé pour évaluer la distribution du nombre de copies par cellule dans l'hybridation in situ par fluorescence (FISH) en interphase, visant à quantifier l'hétérogénéité de l'ADN extrachromosomique (ecDNA) dans le médulloblastome. La moyenne et la variance des nombres de copies estimés par cellule pour tous les gènes marqueurs d'amplification de l'ecDNA étaient nettement plus élevées par rapport à la lignée cellulaire d'ecDNA COLO320-HSR, qui englobe le locus MYC amplifié chromosomiquement. Cela s'aligne avec l'hétérogénéité élevée du nombre de copies observée dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines présentant de l'ecDNA.

Notamment, dans chaque tumeur primitive analysée, seulement 22 % à 41 % des cellules présentaient un nombre de copies amplifié d'ecDNA supérieur à 5. Les informations tirées de la microscopie FISH quantitative et du séquençage unicellulaire multichromosomique indiquent qu'un sous-ensemble de cellules au sein des tumeurs de médulloblastome ecDNA+ abrite des ecDNAs à haute copie. De plus, ces cellules affichent des nombres de copies amplifiés extrachromosomiques simples ou multiples hautement variables. Ces résultats soulignent la nature complexe et dynamique des variations du nombre de copies d'ecDNA au sein du paysage cellulaire des médulloblastomes.

L'analyse des cellules uniques révèle une population de cellules tumorales distincte avec une amplification ecDNA à copies élevées. (Chapman et al., 2023)

Profils transcriptomiques uniques dans les cellules ecDNA+

En utilisant l'algorithme des plus proches voisins pondérés pour le regroupement, une majorité des cellules ecDNA+ ont été regroupées en clusters distincts caractérisés par des éléments uniques. transcriptomique et profils épigénétiquesNotamment, les cellules au sein du cluster ecDNA+ ont montré une surexpression significative des gènes marqueurs amp1 et amp2 DNT IP 2 (test de Wilcoxon, q < 0,001) et KMT2E (q < 0,001). De plus, GLI2 (q < 0,001) était nettement régulé à la hausse dans le cluster de cellules ecDNA+ par rapport aux autres cellules tumorales et normales. L'activité transcriptionnelle des gènes amplifiés par ecDNA a montré une corrélation positive avec l'augmentation du nombre de copies d'ecDNA.

Pour contextualiser ces résultats, des types cellulaires normaux ont été identifiés grâce à l'expression spécifique de clusters de gènes marqueurs connus. L'estimation du nombre de copies génomiques par séquençage d'ARN à noyau unique (snRNA-seq) a corroboré que les cellules normales maintenaient un génome stable, contrastant avec les clusters de cellules tumorales présentant une diversité d'altérations du nombre de copies. Ces résultats mettent en évidence le paysage moléculaire distinct des cellules ecDNA+, soulignant leurs signatures transcriptionnelles uniques et les altérations génomiques sous-jacentes par rapport aux cellules tumorales et normales.

l'ecDNA Orchestration de la Position des Oncogènes au sein d'un Paysage Régulatoire Génique Aberrant

Étant donné les réarrangements génomiques profonds liés à l'ecDNA du médulloblastome, l'étude a examiné si des interactions anormales entre des oncogènes co-amplifiés et des amplificateurs se produisent dans le contexte de l'ecDNA circulaire. Pour explorer cela, la chromatine accessible de 25 tumeurs de médulloblastome a été soumise à une analyse à travers ATAC-seq, tandis que les interactions de la chromatine de 17 tumeurs ont été étudiées à l'aide de la capture de conformation de la chromatine (Hi-C).

Dans la moitié des tumeurs ecDNA+ examinées (D458, MB106, MB268 et RCMB56), des preuves convaincantes d'interactions chromatiniennes aberrantes sur ecDNA ont été identifiées, s'étendant sur des points de rupture structurellement variables. Ces interactions ont facilité la juxtaposition de motifs accessibles et de gènes co-amplifiés provenant de régions génomiques distales. Les données Hi-C ont en outre révélé que le promoteur MYC présentait des interactions avec les chromosomes 8 et des éléments régulateurs co-amplifiés sur le chromosome 14.

Ces résultats soulignent la prévalence des interactions anormales entre les enhancers et les promoteurs résultant de réarrangements structurels de l'ecDNA dans les tumeurs de médulloblastome. L'étude met en lumière les dynamiques régulatrices complexes orchestrées par l'ecDNA, fournissant des informations précieuses sur les bases moléculaires de la pathogénie du médulloblastome.

Les interactions de la chromatine avec MYC sont réorganisées dans un médulloblastome de groupe 3. (Chapman et al., 2023)

Régulation médiée par les amplificateurs de la transcription des oncogènes par amplification d'ecDNA

Un criblage d'amplification CRISPRi complet a été réalisé dans la lignée cellulaire de médulloblastome de type 3 D458, en utilisant 32 530 séquences sgRNA ciblant 645 sites accessibles sur l'ADN extrachromosomique (ecDNA). La même approche de criblage a été appliquée à la lignée cellulaire de type 3 D283, caractérisée par une amplification de MYC dans une région uniformément teintée de 55 Mbp du chromosome 8q. Bien que le promoteur MYC se soit avéré essentiel dans les deux lignées cellulaires, le criblage a identifié six éléments fonctionnels qui ont spécifiquement entravé la prolifération de D458 après 21 jours d'inhibition CRISPRi.

Des résultats supplémentaires de l'écran d'inhibition ont souligné que, bien que l'amplification de MYC propulse la prolifération dans toutes les lignées cellulaires de médulloblastome de type 3, la signification relative des gènes co-amplifiés et des éléments régulateurs cis variait en fonction de la structure génomique de l'amplicon. Cela met en évidence l'interaction nuancée entre les oncogènes amplifiés et les éléments régulateurs associés, éclairant le paysage complexe du contrôle transcriptionnel des oncogènes orchestré par l'amplification d'ecDNA dans le médulloblastome.

Le réajustement des amplificateurs dans l'ecDNA des médulloblastomes affecte la prolifération cellulaire. (Chapman et al., 2023)

Référence:

1. Chapman, O.S., Luebeck, J., Sridhar, S. et al. L'ADN extracromosomique circulaire favorise l'hétérogénéité tumorale dans le médulloblastome à haut risque. Nat Genet 55, 2189–2199 (2023).