Détection de plasmides et séquençage complet de l'ADN plasmidique

Introduction aux Plasmides Bactériens

Les plasmides bactériens sont des molécules d'ADN double brin, circulaires ou linéaires, définies par leur capacité de réplication autonome dans les hôtes. Ils sont des sources critiques pour l'évolution microbienne et l'innovation génomique en raison de leur capacité à acquérir des séquences d'ADN étrangères et à se transférer entre bactéries et entre organismes éloignés, comme le transfert de bactéries vers des eucaryotes via la conjugaison et la mobilisation. Les plasmides bactériens subissent une fréquence de recombinaison génétique plus élevée que les chromosomes. Le génome plasmidique, également connu sous le nom de génome accessoire ou flexible, n'encode pas les fonctions de survie de base, mais contribue plutôt à l'exploitation de niches environnementales particulières, à la pathogénicité, à la dégradation des aromatiques et à la résistance aux antimicrobiens (RAM). La résistance aux antibiotiques a directement et fortement augmenté le nombre de bactéries multirésistantes. Ainsi, des efforts considérables ont été déployés pour la détection et le suivi des plasmides en utilisant des méthodes telles que séquençage complet de l'ADN plasmidique.

Figure 1. Réplication autonome et intégration génomique des plasmides bactériens.

Méthodes de détection des plasmides

La détection des plasmides est une technique fondamentale largement utilisée dans la recherche en biologie moléculaire. Son objectif principal est de déterminer la présence, la taille et la pureté des plasmides, composants essentiels dans l'ingénierie génétique et les études de biologie moléculaire. Les méthodologies de détection des plasmides englobent un éventail d'approches, y compris, mais sans s'y limiter, l'amplification par PCR, l'électrophorèse sur gel, la coloration par fluorescence, le cartographie optique et le séquençage.

Typage de réplicons basé sur la PCR : Cette approche cible les sites de réplicon conservés des plasmides, et la PCR multiplex peut être étendue pour cibler simultanément de nombreux réplicons. Bien que peu coûteuse et rapide, cette approche est difficile à appliquer à tous les nouveaux groupes de plasmides.

Électrophorèse en champ pulsé (PFGE) : Cette méthode sépare l'ADN digéré sur une matrice de gel en appliquant un champ électrique qui change périodiquement de direction. Cependant, il faut généralement plusieurs jours pour révéler la taille et le nombre de plasmides dans un isolat.

Figure 2. Électrophorèse en gel à champ pulsé (Hu & Manos 2015)

Cartographie optique des plasmides : Cette méthode reposant sur l'étirement de l'ADN plasmidique peut être utilisée pour représenter la séquence d'un plasmide. Cependant, le mapping optique peut ne pas être adapté à la détection de plasmides courts (< 50 Kb).

Figure 3. Cartographie optique des plasmides (Bogas et al., 2017).

Spectrophotométrie UV : La spectrophotométrie UV, une technique largement utilisée, sert à déterminer la concentration et la pureté des échantillons d'acides nucléiques, y compris l'ADN plasmidique. Les acides nucléiques absorbent la lumière UV autour de 260 nm. En mesurant l'absorbance à cette longueur d'onde, la concentration d'ADN dans la solution peut être déterminée avec précision.

Digestion par des enzymes de restriction : La digestion de plasmides avec des enzymes de restriction est une étape cruciale, où le schéma de clivage attendu des enzymes est utilisé pour confirmer la présence et la taille des plasmides.

Coloration par fluorescence : L'utilisation de colorants fluorescents tels que SYBR Green permet la visualisation et la quantification des plasmides par la détection de leurs signaux de fluorescence.

Détection de plasmides basée sur le séquençage : Avec le développement des technologies de séquençage à haut débit, il est possible d'obtenir toutes les informations contenues dans les plasmides. Séquençage du génome entier (SGE) peut capturer à la fois des données de séquences bactériennes et plasmidiques. L'utilisation d'algorithmes tels que PlasmidSeeker et plasmidSPAdes permet d'extraire et d'assembler des données plasmidiques à partir de projets de séquençage génomique complet (WGS). Cependant, ces outils ne peuvent détecter que des séquences plasmidiques connues à partir de données WGS brutes. Afin d'analyser de manière exhaustive les plasmides, séquençage complet de l'ADN plasmidique fournit un outil puissant pour obtenir la séquence complète du plasmide.

Qu'est-ce que le séquençage complet de l'ADN plasmidique ?

Séquençage complet de l'ADN plasmidique, également connu sous le nom de séquençage complet de plasmide ou séquençage intégral de plasmide, fait référence au processus de détermination et d'analyse de l'ensemble de la séquence d'ADN d'un plasmide. Cette méthode de séquençage permet d'obtenir une vue d'ensemble complète de la configuration totale du plasmide, incorporant des gènes, des amorces, des promoteurs et d'autres séquences critiques qu'il peut contenir. Tirant parti des capacités de Séquençage de nouvelle génération (NGS), Séquençage PacBio, ou Séquençage par nanopore, cela permet le séquençage de toutes les séquences nucléotidiques au sein de tout plasmide donné. Cette approche facilite une caractérisation complète des plasmides inconnus et une vérification approfondie de ceux qui sont connus. Il est à noter que cette méthode ne nécessite pas d'amorces ni ne repose sur une base de données de référence.

Le rôle de Séquençage complet de l'ADN plasmidique:

Vérification de l'intégrité de la séquence : Au cours du processus de clonage ou d'amplification, les plasmides peuvent subir des modifications génétiques, ce qui peut entraîner des erreurs de séquence ou des mutations indésirables.

Contrôle de la qualité dans le clonage et l'ingénierie : Le séquençage des plasmides sert de étape de contrôle qualité, validant l'exactitude des inserts clonés, confirmant l'absence de mutations indésirables et garantissant l'intégrité du système expérimental.

Optimisation de la conception expérimentale : Une connaissance précise de la séquence d'un plasmide permet aux chercheurs de concevoir des expériences plus efficacement. La compréhension complète de la composition d'un plasmide fournit des informations fondamentales qui pourraient orienter les manipulations conçues et prédire leurs résultats possibles.

Figure 4. Diagramme circulaire du plasmide

Processus de séquençage complet de l'ADN plasmidique

Le flux de travail pour le séquençage complet de plasmides comprend préparation d'ADN plasmidique et le contrôle de qualité (CQ), la construction de bibliothèques et le CQ, le séquençage et l'analyse bioinformatique (y compris le CQ des données, l'assemblage de novo et l'analyse ultérieure). Pour le séquençage de nouvelle génération (NGS), il est difficile d'obtenir des assemblages contigus de plasmides car la longueur des lectures, généralement inférieure à environ 400 à 500 pb, ne peut pas couvrir la longueur complète de la plupart des éléments génétiques mobiles. Ainsi, les assemblages de plasmides à partir de données NGS sont souvent fragmentés ou incomplets. Le séquençage de troisième génération, également connu sous le nom de séquençage à longues lectures, comprend le séquençage PacBio et Nanopore, offrant un séquençage rapide des plasmides et permettant dans de nombreux cas l'assemblage complet des plasmides jusqu'à leur fermeture. Les principaux avantages de l'utilisation Séquençage de nouvelle génération (NGS) les avantages de la séquençage complet de plasmides résident dans sa précision supérieure et ses capacités de haut débit. En revanche, les principaux avantages de Technologie des nanopores se manifestent dans sa performance optimale avec un contenu élevé en GC et des structures de Répétition Terminale Inversée (RTI). D'autres attributs incluent des longueurs de lecture étendues et des délais de traitement réduits.

Plusieurs précautions doivent être prises lors du séquençage complet de l'ADN plasmidique :

• Utilisez des méthodes d'extraction appropriées et des kits d'extraction d'ADN plasmidique pour éviter la contamination et la dégradation. Par la suite, une mesure précise de la concentration d'ADN plasmidique doit être effectuée à l'aide de méthodes colorimétriques ou fluorescentes, en veillant à utiliser des quantités d'ADN identiques dans les expériences suivantes.
• En fonction des exigences expérimentales et du type d'échantillons, la méthode de construction de bibliothèque appropriée, telle que l'amplification par PCR ou la méthode des transposons, doit être sélectionnée. Lors de l'utilisation de l'amplification par PCR, les conditions de PCR doivent être optimisées pour prévenir les biais d'amplification et l'introduction de produits hybrides, garantissant ainsi une longueur uniforme des fragments d'ADN plasmidique dans la bibliothèque.
• Le logiciel de contrôle qualité doit être appliqué pour filtrer et couper les données de séquençage, éliminant les lectures de faible qualité et les séquences d'adaptateurs afin d'améliorer l'exactitude des analyses ultérieures.
• Des groupes de contrôle appropriés, y compris des contrôles positifs, négatifs et blancs, doivent être établis. Cela garantit la fiabilité et la précision des résultats expérimentaux. La répétition des expériences renforce la validation, augmentant ainsi la crédibilité des résultats.

Application de séquençage complet de l'ADN plasmidique

Dans la recherche en génie génétique et en biologie moléculaire, séquençage complet de plasmides est utilisé pour vérifier l'exactitude et l'intégrité des constructions de plasmides. Grâce à l'analyse de séquençage, on peut affirmer la présence de séquences génétiques souhaitées, de promoteurs, de tags, etc., au sein du plasmide, garantissant ainsi la conformité avec les anticipations de conception. En ce qui concerne la recherche sur la fonction des gènes, le séquençage complet du plasmide peut éclairer les fonctionnalités et les mécanismes régulateurs des gènes présents dans le plasmide. En analysant les séquences de plasmides, nous pouvons identifier les gènes portés par le plasmide et approfondir notre compréhension des fonctions de ces gènes, de leurs patterns d'expression et de leurs réseaux régulateurs au sein de la cellule.

Dans la recherche sur les maladies, séquençage complet de plasmides est utilisé pour identifier les variations de plasmides et les mutations associées à la maladie. En comparant les séquences de plasmides provenant d'échantillons de patients avec des échantillons témoins, des marqueurs génétiques potentiels liés au début et à la progression de la maladie peuvent être identifiés. En ce qui concerne le développement de médicaments et la thérapie ciblée, le séquençage complet des plasmides peut aider à identifier des cibles médicamenteuses potentielles. En analysant les gènes et les éléments régulateurs au sein du plasmide, de nouvelles cibles associées à des maladies spécifiques peuvent être identifiées, offrant de nouvelles directions pour la conception et le développement de médicaments.

dans le domaine de la recherche en microbiologie environnementale, le séquençage complet des plasmides constitue un outil précieux pour analyser la composition et la fonctionnalité des plasmides microbiens au sein d'échantillons environnementaux. En examinant le répertoire des plasmides microbiens et leurs attributs fonctionnels, cette approche contribue à une compréhension globale des traits métaboliques microbiens, des rôles écologiques et des stratégies d'adaptation dans divers contextes environnementaux. De plus, dans le domaine des études génétiques, séquençage complet de plasmides facilite l'élucidation de la diversité génétique des plasmides et des relations évolutives entre différentes espèces et populations. Cela aide à déchiffrer les rôles des plasmides dans la transmission génétique et les processus d'adaptation des espèces, enrichissant ainsi notre compréhension des dynamiques évolutives et des mécanismes génétiques sous-jacents aux communautés microbiennes.

Séquençage complet de plasmides et séquençage Sanger

Séquençage de Sanger et séquençage complet de plasmides représentent deux techniques largement mises en œuvre pour le séquençage de l'ADN, chacune offrant des caractéristiques uniques tout en maintenant une relation intégrale l'une avec l'autre. Le séquençage de Sanger fonctionne principalement sur la méthode de terminaison de chaîne, spécialement adaptée pour le séquençage de brins d'ADN plus courts tels que des gènes spécifiques ou des séquences d'amorces. Cette technique est également utile pour la détection de mutations génétiques spécifiques. En termes de rapport coût-efficacité, le séquençage de Sanger offre une solution relativement abordable, ce qui le rend adapté aux projets de séquençage à plus petite échelle.

Séquençage complet de plasmides représente une technique sophistiquée pour séquencer l'ADN complet d'un plasmide. Cette technique exploite principalement la puissance du séquençage de nouvelle génération (NGS) ou du séquençage à longues lectures pour déterminer la séquence de l'ADN plasmidique complet. Traditionnellement, la méthode de séquençage comprend l'amplification de l'ADN plasmidique par réaction en chaîne par polymérase (PCR), suivie du séquençage à haut débit des produits amplifiés permettant de récupérer la séquence complète du plasmide. Cette méthode robuste est particulièrement adaptée à une large gamme d'applications, y compris la construction et la validation de plasmides, la recherche sur les maladies et les études de microbiologie environnementale. Malgré le coût relativement élevé associé au séquençage complet des plasmides, cette technique facilite l'accès à l'ensemble de la séquence d'un plasmide, en faisant un outil inestimable pour des projets de séquençage expansifs nécessitant des analyses complètes.

Bien que le séquençage Sanger et séquençage complet de plasmides s'adapter à la détermination des séquences d'ADN et peuvent obtenir des informations sur les séquences d'ADN via des machines de séquençage, elles peuvent effectivement se compléter sous certaines conditions. Par exemple, lors du processus de construction de plasmides, le séquençage de Sanger peut être utilisé pour vérifier des régions spécifiques du plasmide, tandis que le séquençage complet du plasmide peut garantir l'intégralité et la précision du plasmide.

Références :

1. Roosaare M, Puustusmaa M, Möls M, et al. PlasmidSeeker : identification des plasmides connus à partir des lectures de séquençage du génome entier bactérien. PeerJ, 2018, 6 : e4588.
2. Gutiérrez-Barranquero J A, Cazorla F M, de Vicente A, et al. Séquence complète et analyse génomique comparative de huit plasmides natifs de Pseudomonas syringae appartenant à la famille pPT23A. BMC génomique, 2017, 18(1) : 365.
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4. Bogas D, Nyberg L, Pacheco R, et al. Applications de la cartographie optique de l'ADN en microbiologie. BioTechniques, 2017, 62(6) : 255-267.
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6. Hu H, Manos J. Électrophorèse en champ pulsé de Pseudomonas aeruginosa // Électrophorèse en champ pulsé. Humana Press, New York, NY, 2015 : 157-170.