Introduction aux microsatellites et au génotypage des microsatellites

Qu'est-ce que les microsatellites ?

Les microsatellites, également connus sous le nom de répétitions en tandem courtes (STR) ou de répétitions de séquences simples (SSR), sont des séquences répétitives en tandem dans lesquelles l'unité répétée contient de un à six nucléotides. Le nombre de répétitions est très variable dans les populations et au sein des allèles d'un individu, car les microsatellites sont sujets à des glissements lors de la réplication de l'ADN. Malgré l'instabilité des microsatellites qui se produit dans toutes les cellules en division, les microsatellites restent stables en longueur grâce au système MMR, qui joue un rôle majeur dans la réparation des erreurs de réplication de l'ADN et la régulation des événements de recombinaison.

Microsatellites : marqueurs génétiques informatifs

Les microsatellites sont des marqueurs génétiques importants car ils ont tendance à être très polymorphes, et ils ont été utilisés comme marqueurs spécifiques au sexe, marqueurs spécifiques à une population, etc. Avec l'avènement de la PCR, les polymorphismes des marqueurs microsatellites ont remplacé les RFLP en tant que marqueurs pour la construction de cartes de liaison. Les régions flanquantes sont critiques car elles permettent aux chercheurs de concevoir des amorces spécifiques au locus pour amplifier les microsatellites via la PCR. C'est-à-dire que les amorces pour la PCR sont les séquences des régions flanquantes uniques. En développant une amorce directe et une amorce inverse de chaque côté du microsatellite, nous sommes en mesure d'amplifier une région microsatellite spécifique au locus pour déterminer la variation des microsatellites.

Avantages des microsatellites en tant que marqueurs génétiques :

• Hautement polymorphe. La raison semble être la réplication par glissement.
• Spécifique au locus. Les amorces spécifiques au locus nous permettent d'amplifier des microsatellites spécifiques au locus.
• Codominant (en contraste avec les RAPD et les AFLP qui sont « binaires, 0/1 »).
• Basé sur la PCR. Nous travaillons avec de petites quantités d'ADN à l'aide d'instruments de laboratoire peu coûteux.
• Une gamme d'échelles allant de l'identification individuelle aux phylogénies à fine échelle.

Applications des marqueurs de microsatellites

Les marqueurs microsatellites sont très utiles (i) dans les études de diversité biologique mesurée sur la base de la distance génétique ; (ii) pour estimer le flux génétique et les taux de recombinaison ; (iii) pour inférer les relations génétiques infraspécifiques ; (iv) pour construire des cartes de liaison et définir des empreintes génétiques de cultivars ; (v) pour cartographier des loci impliqués dans des traits quantitatifs ; (vi) pour déterminer le degré de parenté ; (vii) dans l'élevage utilisant la sélection assistée par marqueurs. Autrement dit, ces marqueurs sont particulièrement utiles dans les études de structure de population, de cartographie génétique et d'évolution.

Figure 1. Étapes du flux de travail pour le développement de marqueurs SSR (microsatellites).

Génotypage de microsatellites

Génotypage est le processus d'identification du génotype de chaque microsatellite. Le flux de travail de génotypage de microsatellites implique généralement la conception de primers spécifiques, l'amplification de microsatellites et le test de polymorphisme.

• Conception de primers spécifiques

Si quelqu'un a développé des amorces SSR pour une espèce étroitement apparentée, ces amorces vaudront la peine d'être vérifiées dans votre espèce. Cependant, s'il n'y a pas d'amorces développées pour des espèces apparentées, vous devrez peut-être concevoir les vôtres. Il est nécessaire d'avoir d'abord les séquences nucléotidiques, soit à partir de votre propre projet de séquençage, soit à partir de la base de données de nucléotides NCBI. Les motifs SSR peuvent être identifiés à l'aide de l'outil d'identification des microsatellites (MISA) (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa). Des amorces SSR spécifiques au locus peuvent être conçues avec SSRLocator v1.0.

• Amplification de microsatellites

Une fois que les amorces SSR ont été développées, il est nécessaire de valider ces amorces en utilisant l'amplification PCR. Chaque mélange de réaction SSR-PCR de 20 µL se compose de polymérase d'ADN, d'un tampon de réaction à 1×, de 2 mmol L.^-1 MgCl2, 40 µmol L^-1 mélange de dNTP, 0,5 umol L^-1 amorçage direct, 0,5 umol L^-1 amorçage inverse, et 50 ng d'ADN génomique. Le cyclage thermique est effectué dans un instrument PCR selon les conditions suivantes : dénaturation initiale à 94°C pendant 5 min, 36 cycles de dénaturation à 94°C pendant 50 s, hybridation à la température optimale pendant 1 min, et extension à 72°C pendant 1 min, ainsi qu'une extension finale à 72°C pendant 7 min.

• Test de polymorphisme

Les résultats de la PCR peuvent être visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose ou par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Le génotypage par PAGE est laborieux mais offre une bonne résolution. Pour des études à échelle fine, des amorces SSR marquées peuvent être synthétisées avec un colorant fluorescent pour le génotypage par électrophorèse capillaire à l'aide d'instruments tels que l'ABI 3730 DNA Analyzer. Dans ce cas, chaque produit PCR est chargé dans une capillaire contenant une matrice de polyacrylamide dans laquelle l'électrophorèse est réalisée. La fluorescence émise est capturée et la masse moléculaire du produit PCR est déterminée. Un électrophéragramme est ensuite généré, montrant des pics de luminescence correspondant à chaque allèle amplifié.

Références :

1. Vieira M L C, Santini L, Diniz A L, et al.. Marqueurs microsatellites : ce qu'ils signifient et pourquoi ils sont si utiles. Génétique et biologie moléculaire, 2016, 39(3) : 312-328.
2. Saha D, Rana R S, Chakraborty S, et al.Développement d'un ensemble de marqueurs SSR pour la détection du polymorphisme génétique et l'hybridation interspécifique du jute. The Crop Journal, 2017, 5(5) : 416-429.
3. Guichoux E, Lagache L, Wagner S, et al.. Tendances actuelles en génotypage de microsatellites. Ressources en écologie moléculaire, 2011, 11(4) : 591-611.