Assemblage métagénomique hybride pour le séquençage NGS et le séquençage à longues lectures : des clés pour la recherche sur les microbiomes.

Alors que séquençage métagénomique est devenu un outil clé, l'identification des voies génomiques et fonctionnelles au sein du microbiome reste un défi dans le séquençage de nouvelle génération en raison des limitations associées aux lectures courtes (~300 pb). Séquençage à lecture longue, comme le séquençage par nanopore (ONT), devrait contourner ces difficultés en fournissant des lectures plus longues (>3 kilobases). Le séquençage à longues lectures aide à combler les répétitions inter-génomiques et à produire une meilleure assemblage de novo des génomes. De telles assemblées métagénomiques hybrides utilisant des données à courtes et à longues lectures ont été utilisées dans des études sur le microbiome humain et des études métagénomiques dans divers environnements complexes. Certains cas sont présentés ci-dessous.

OPERA-MS, un assembleur métagénomique hybride

Le processus OPERA-MS, qui utilise d'abord MEGAHIT, metaSPAdes ou IDBA-UD pour l'assemblage de courtes séquences, utilise ensuite de longues séquences pour construire le cadre génomique, puis regroupe davantage les clusters de gènes des sous-espèces bactériennes. Et enfin, évalue la capacité d'assemblage.

OPERA-MS, qui combine le regroupement métagénomique avec le regroupement sensible aux répétitions, peut assembler avec précision des communautés bactériennes complexes. Les auteurs ont constaté qu'OPERA-MS assemblait des paires de bases plus précises que l'assembleur de longues séquences (Canu), des résultats d'assemblage plus cohérents que l'assembleur de courtes séquences (MEGAHIT23, metaSPAdes24, IDBA-UD25) et des taux d'erreur plus faibles que l'assembleur hybride non métagénomique (hybridSPAdes). Le processus peut également être assemblé en présence de plusieurs isoformes bactériennes. OPERA-MS peut assembler des génomes de haute qualité d'espèces rares (<1%) avec une couverture de lectures longues de 9×, et des génomes presque complets avec une couverture plus élevée.

Flux de travail d'OPERA-MS (Bertrand D) et al. 2019)

L'assemblage hybride de métagénomes permet une analyse de haute précision des gènes de résistance et des éléments mobiles.

L'analyse de la composition du microbiome a été réalisée grâce au séquençage métagénomique à haut débit. Cependant, les méthodes existantes ne sont pas conçues pour assembler des séquences mixtes provenant de lectures courtes et longues. Les chercheurs ont utilisé le logiciel d'assemblage métagénomique hybride OPERA-MS, qui combine l'assemblage utilisant le regroupement sensible aux répétitions et des méthodes d'étayage précises pour obtenir un assemblage précis de communautés complexes.

Des chercheurs ont collecté 197 échantillons cliniques d'intestins colonisés par des Entérobactéries résistantes aux carbapénèmes pour un séquençage métagénomique à lecture longue et à lecture courte. Le métagénome intestinal de 28 patients traités par antibiotiques a été assemblé à l'aide d'OPERA-MS et montre que le mélange de données avec des longueurs de lecture longues par nanopore permet d'obtenir des assemblages plus contigus (une amélioration de 200 fois par rapport aux assemblages à lecture courte), y compris plus de 80 séquences de plasmides ou de phages formant des boucles et un nouveau phage géant de 263 kpb. Un logiciel d'assemblage hybride de haute qualité permet d'obtenir une vue détaillée de la résistance aux antibiotiques intestinaux chez les patients humains.

Éléments mobiles et association avec les espèces hôtes dans le microbiome intestinal humain (Bertrand D) et al. 2019)

L'assemblage métagénomique hybride relie la structure des glucides à la fonction dans le microbiome intestinal humain.

La diversité microbienne au sein du microbiote et ses interactions avec la santé et la nutrition de l'hôte sont désormais largement étudiées. Un rôle important du microbiote intestinal humain est la dégradation métabolique des glucides complexes provenant de sources végétales et animales (par exemple, les légumineuses, les graines, les tissus et le cartilage). Les acides gras à chaîne courte sont le principal produit de la fermentation des glucides par le microbiote intestinal. Cependant, comprendre la complexité du métabolisme des glucides complexes dans le microbiote intestinal représente un grand défi.

Dans cette étude, les chercheurs ont utilisé l'assemblage métagénomique hybride pour évaluer les changements de composition au niveau des espèces dans le microbiote individuel du modèle de contrôle pour six glucides structurellement distincts. Des N50 plus grands et les plus longs clusters chevauchants ont été trouvés en utilisant des assemblages hybrides par rapport aux assemblages à courtes lectures. Cinq cent neuf génomes assemblés à partir de métagénomes de haute qualité (MAGs) appartenant à 10 classes bactériennes et 28 familles bactériennes ont été identifiés. Les espèces bactériennes identifiées comme portant des gènes de module de liaison à l'amidon ont montré une augmentation substantielle en réponse à l'amidon. Grâce à l'application de la métagénomique hybride, plusieurs espèces non cultivées avec un potentiel fonctionnel pour dégrader les substrats d'amidon peuvent être identifiées et utilisées pour de futures études.

L'arbre phylogénétique a été construit à partir de séquences protéiques concaténées en utilisant PhyloPhlAn et illustré avec ggtree (Ravi A et al. 2022)

Résumé

Le séquençage métagénomique en lecture longue et en lecture courte, ainsi que l'assemblage hybride, ont un grand potentiel pour l'étude du microbiote intestinal humain. L'assemblage hybride des métagénomes permet non seulement d'obtenir une grande précision des bases, mais aussi une amélioration d'un ordre de grandeur de la longueur de jonction des données de séquençage en lecture courte, permettant ainsi l'assemblage de génomes plus proches de la complétude, y compris des génomes de haute qualité pouvant révéler des sous-espèces bactériennes, des microbes rares, des plasmides et des phages dans des échantillons complexes.

Références :

1. Bertrand D, Shaw J, Kalathiyappan M, et al. L'assemblage métagénomique hybride permet une analyse à haute résolution des déterminants de résistance et des éléments mobiles dans les microbiomes humains. Biotechnologie de la nature, 2019, 37(8) : 937-944.
2. Ravi A, Troncoso-Rey P, Ahn-Jarvis J, et al. Les assemblages de métagénomes hybrides relient la structure des glucides à la fonction dans le microbiome intestinal humain. Biologie des communications, 2022, 5(1) : 1-13.