Séquençage de la sélection de bibliothèque de phages : Introduction, flux de travail et applications

Introduction au séquençage de dépistage des anticorps ou dépistage de bibliothèque de phages

L'affichage de phages est un outil de laboratoire populaire et efficace pour découvrir des peptides qui se lient à n'importe quelle cible. Cette méthode est généralement basée sur des bibliothèques de particules de phages contenant des millions, voire des milliards de peptides exogènes liés à des protéines de surface de phage. La bibliothèque hautement diversifiée est réduite à quelques pistes à travers plusieurs cycles de sélection, également connus sous le nom de biopanning, et une amplification est nécessaire pour renforcer les clones de phages qui présentent des peptides de liaison à la cible, afin d'évaluer les ligands avec une haute affinité et spécificité. Étant donné que des fragments d'anticorps tels que scFv ou Fab sont rapidement exprimés et affichés sur des phages, la technologie d'affichage de phages joue un rôle crucial dans la découverte et l'ingénierie des anticorps.

L'analyse des séquences peptidiques dans la bibliothèque est cruciale pour l'affichage de phages. Des clones de phages individuels doivent être isolés pour le séquençage Sanger conventionnel. C'est un processus long et à petite échelle qui repose sur une amplification répétée. Les limites de la méthode incluent la génération d'un biais sélectif non intentionnel contre certaines séquences d'anticorps dans les bactéries et l'incapacité à évaluer plus d'une centaine de clones de bibliothèque.

Lorsqu'il s'agit d'analyser écrans de phage-display, Le séquençage profond Illumina présente de nombreux avantages, notamment pour les grandes collections de séquences. Pour commencer, il permet des expériences d'affichage de phages avec moins, et finalement juste un, tour de sélection, évitant potentiellement les problèmes causés par des biais indésirables et l'effondrement de la diversité pendant le processus d'amplification, permettant ainsi la découverte de ligands qui étaient auparavant perdus ou sous-représentés dans les écrans d'affichage de phages. De plus, les plateformes NGS peuvent caractériser jusqu'à 10⁶–10⁸ séquences en une seule exécution, permettant une couverture de contenu beaucoup plus représentative et donc utile.

Figure 1. Un aperçu du processus de sélection des phages. (Christiansen, 2015)

Flux de travail général pour le séquençage de dépistage d'anticorps

Les lignes directrices de base pour le séquençage de dépistage des anticorps sont les suivantes :

- En utilisant diverses trypsines, la protéine d'anticorps est d'abord digérée en peptides qui se chevauchent.

- Digestion par LC-MS/MS, suivie de l'optimisation de la fragmentation

Le séquençage de peptides de novo est utilisé pour identifier des peptides chevauchants.

- Assemblage automatisé de séquences d'anticorps à l'aide de peptides qui ont été catégorisés

- Les données sont analysées à l'aide d'algorithmes computationnels de pointe pour déterminer rapidement la séquence d'acides aminés du peptide digéré. Applications du séquençage de dépistage d'anticorps.

Découverte d'anticorps par séquençage des répertoires immunitaires

Diverss compartiments immunitaires de différents hôtes mammifères ont été explorés après immunisation afin de trouver de nouveaux anticorps monoclonaux en utilisant le séquençage à haut débit et l'évaluation bioinformatique. Trois méthodes différentes se sont révélées efficaces à cet égard.

Séquençage des répertoires d'anticorps recombinants

L'Ig-seq peut être utilisé pour étudier une variété de bibliothèques d'anticorps recombinants, y compris des bibliothèques naïves, ciblées, immunitaires, semi-synthétiques et entièrement synthétiques, en plus de l'exploitation directe des répertoires d'anticorps dérivés des cellules B naturelles d'animaux et d'humains. Des plateformes de criblage in vitro telles que l'affichage de phages, de levures et de ribosomes sont adaptées à ces répertoires. L'un des principaux objectifs de ces efforts de séquençage est de capturer et de déduire des métriques de qualité de bibliothèque qui indiquent la probabilité d'isoler efficacement des anticorps avec des caractéristiques préférées à partir d'une bibliothèque recombinante fournie.

Combinaison du criblage à haut débit et du séquençage pour la découverte et l'ingénierie d'anticorps monoclonaux

Pour que le séquençage à haut débit offre une perspective approfondie significative des variétés possibles de bibliothèques spécifiques aux antigènes, la diversité doit être considérablement réduite afin d'obtenir la pleine capacité d'une bibliothèque d'anticorps naturelle ou recombinante donnée (généralement dans la plage de 10^6 à 10^11 clones). En conséquence, l'intégration de l'Ig-seq avec un filtre de séquence basé sur le phénotype et une pression de sélection, comme celles fournies par l'affichage de phages ou de levures, est une méthode réalisable pour interroger sélectivement les bibliothèques d'anticorps en profondeur.

Références :

1. Fischer N. Séquençage des répertoires d'anticorps : la prochaine génération. InMAbs 1er janvier 2011 (Vol. 3, No. 1, pp. 17-20). Taylor & Francis.
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3. Thompson KL, Rosenzweig BA, Pine PS, et al.Utilisation d'un design RNA à tissu mixte pour les évaluations de performance sur plusieurs formats de microarrays. Recherche sur les acides nucléiques2005 1 janv.;33(22).
4. Christiansen A, Kringelum JV, Hansen CS, et al.Le séquençage à haut débit amélioré par l'affichage de phages permet l'identification de motifs d'épitopes spécifiques aux patients dans le sérum. Rapports scientifiques. 6 août 2015 ; 5(1).