Qu'est-ce que le séquençage par cycles ?

Dans le domaine de l'analyse génétique, le séquençage par cycles émerge comme un sommet de précision et d'efficacité, offrant aux chercheurs un instrument puissant pour déchiffrer les complexités intégrées dans l'ADN. Dérivé comme une amélioration de la technique de séquençage Sanger conventionnelle, le séquençage par cycles a métamorphosé le paysage du séquençage génétique, facilitant une analyse exhaustive caractérisée par une précision et une rapidité sans précédent. Dans ce discours, nous entreprenons une exploration complète du séquençage par cycles, en élucidant ses principes fondamentaux, ses nuances procédurales et ses multiples applications dans le domaine de l'examen génétique.

Comprendre le séquençage cyclique : un examen approfondi des principes fondamentaux

Le séquençage par cycles incarne une fusion nuancée des méthodologies de biologie moléculaire, harmonisant des aspects du séquençage Sanger classique avec l'efficacité inhérente à la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Au cœur de cette technique, le séquençage par cycles vise à élucider le plan génétique encapsulé dans les molécules d'ADN avec un degré de précision et de fidélité sans égal.

Principe de terminaison de chaîne

Au cœur du séquençage par cycles se trouve le principe fondamental de la terminaison de chaîne, un aspect fondamental du paradigme de séquençage de Sanger. Dans ce cadre, la synthèse de l'ADN rencontre une interruption à des intervalles précis le long du modèle d'ADN grâce à l'intégration de didéoxynucléotides (ddNTPs). Dépourvus d'un groupe 3'-OH, ces ddNTPs entravent l'ajout ultérieur de nucléotides par l'enzyme ADN polymérase, induisant ainsi l'arrêt de la synthèse de l'ADN.

Intégration du cycle PCR

La caractéristique distinctive qui distingue le séquençage par cycles de son homologue traditionnel, le séquençage de Sanger, est son incorporation d'un cycle de type PCR. Contrairement à la trajectoire linéaire de la synthèse de l'ADN observée dans le séquençage de Sanger, le séquençage par cycles exploite le cyclage thermique au sein d'un thermocycleur pour orchestrer la dénaturation, l'hybridation et l'extension itératives des fragments d'ADN. Cette modalité cyclique amplifie l'efficacité et la résilience de la réaction de séquençage, permettant ainsi l'acquisition de données de séquençage même à partir de faibles quantités d'ADN modèle.

Utilisation de la polymérase d'ADN thermo-stable

Au cœur du séquençage par cycles se trouve un facilitateur essentiel : l'utilisation d'une ADN polymérase thermo-stable, illustrée par la polymérase Taq. Cette entité enzymatique manifeste une résilience exceptionnelle à des températures élevées, facilitant ainsi les cycles itératifs de dénaturation et de synthèse intrinsèques au séquençage par cycles. De plus, la thermo-stabilité inhérente à l'ADN polymérase réduit la probabilité de dénaturation de l'enzyme, protégeant ainsi la fidélité de la synthèse de l'ADN tout au long de l'ensemble du processus de séquençage.

Étiquetage des amorces de séquençage

Un autre aspect crucial du séquençage par cycles concerne le marquage des amorces de séquençage, des entités essentielles qui initient la synthèse de l'ADN. Traditionnellement, ces amorces sont marquées avec des colorants fluorescents ou des isotopes radioactifs, facilitant la visualisation et la détection des fragments d'ADN synthétisés. Grâce à l'intégration d'amorces marquées dans le milieu de séquençage, les chercheurs peuvent méticuleusement déchiffrer la séquence de nucléotides intégrée dans le modèle d'ADN.

Séparation et analyse des fragments

Après l'aboutissement de la procédure de séquençage par cycles, les fragments d'ADN synthétisés subissent une séparation selon leur taille, en utilisant soit l'électrophorèse capillaire, soit l'électrophorèse sur gel. Par la suite, les fragments marqués par fluorescence sont identifiés et examinés, chaque signal fluorescent correspondant à un nucléotide distinct assimilé lors de la synthèse de l'ADN. En s'appuyant sur des algorithmes d'analyse de données complexes, les chercheurs entreprennent la tâche délicate de déchiffrer la séquence d'ADN en déduisant l'agencement séquentiel des signaux fluorescents détectés.

Figure 1 Schéma de la réaction de séquençage par cycle. Des modèles à double ou simple brin sont soumis à un cycle de réaction à trois températures comprenant une dénaturation à haute température, un appariement des amorces et une extension/termination des amorces (Keith Kretz, et al., 2024)

Séquençage de cycle vs PCR

La séquençage par cycles et la PCR sont des techniques de biologie moléculaire utilisées dans l'analyse de l'ADN, mais elles ont des objectifs divergents et utilisent des méthodologies distinctes. La PCR sert principalement à amplifier des séquences d'ADN spécifiques, facilitant ainsi la génération de nombreuses copies d'une région ciblée de l'ADN. En revanche, le séquençage par cycles vise à élucider la séquence de nucléotides d'un fragment d'ADN.

Séquençage par cycle vs Séquençage de Sanger

Séquençage par cycles et Séquençage de Sanger, tout en appartenant tous deux au domaine de Séquençage de l'ADN Les méthodes présentent des distinctions dans leurs méthodologies et approches. Le séquençage Sanger, conçu par Frederick Sanger dans les années 1970, représente la modalité conventionnelle de séquençage de l'ADN, tandis que le séquençage par cycles émerge comme une itération évoluée de cette technique, conçue pour augmenter l'efficacité et le débit.

Les étapes du séquençage cyclique

Le séquençage par cycles, une extension du classique Séquençage de Sanger méthode, englobe une série de procédures essentielles visant à l'amplification précise et au séquençage de fragments d'ADN.

1. Étiquetage et préparation des amorces

La première étape consiste à étiqueter les amorces de séquençage, soigneusement conçues pour s'hybrider à la séquence d'ADN cible, déclenchant ainsi la synthèse de l'ADN. Dans le séquençage par cycles, les amorces sont marquées avec un colorant fluorescent ou une étiquette radioactive, facilitant la détection ultérieure. Ces amorces étiquetées subissent une préparation minutieuse, au cours de laquelle elles sont hybridées à l'ADN modèle simple brin, en présence d'une enzyme ADN polymérase et d'un mélange de désoxynucléotides (dNTPs).

2. Cyclage thermique

Suite à la phase d'assemblage des amorces dans l'ADN modèle, le mélange réactionnel est soumis à un processus connu sous le nom de cyclage thermique. Ce processus crucial comprend une série régulée d'oscillations de température conçues pour accélérer la dénaturation de l'ADN, faciliter l'assemblage des amorces et stimuler la synthèse de l'ADN.

Typiquement, le mélange de réaction est d'abord exposé à une condition thermique élevée propice à la dénaturation de l'ADN. Cette élévation de température calculée induit la séparation de l'ADN double brin en brins individuels. Par la suite, une réduction de la température est initiée, favorisant la phase d'hybridation des amorces. Au cours de cette dernière étape, les amorces se lient sélectivement à leurs séquences complémentaires respectives présentes dans l'ADN modèle.

Enfin, un régime de température intermédiaire est utilisé pour initier et favoriser le processus de synthèse de l'ADN. Tout au long de cette phase, la machinerie enzymatique représentée par l'ADN polymérase prolonge substantiellement l'amorce. Ce processus d'extension est réalisé grâce à la capacité inhérente de la polymérase à incorporer de manière séquentielle des nucléotides complémentaires dans le brin modèle, guidant ainsi l'assemblage architectural approprié de la nouvelle molécule d'ADN.

3. Incorporation de nucléotides terminant la chaîne

Lors du début de la phase de synthèse de l'ADN, une espèce de nucléotides connue sous le nom de didéoxynucléotides (ddNTPs), appelés nucléotides terminant la chaîne, est intégrée dans le filament d'ADN en développement. Ces ddNTPs particuliers sont dépourvus d'un groupe 3'-OH, ce qui empêche toute poursuite de la synthèse de l'ADN après leur ajout à la chaîne en expansion. Par conséquent, cela entraîne l'arrêt de la synthèse de l'ADN à chaque emplacement respectif de ddNTP, aboutissant à la production d'une série de fragments d'ADN de longueurs disparates.

4. Séparation et Détection

À l'issue des réactions thermocycliques, les fragments d'ADN générés sont distingués selon leurs tailles respectives par des modalités telles que l'électrophorèse sur gel ou l'électrophorèse capillaire. Après séparation, ces fragments subissent une détection et une visualisation ultérieures soit par détection par fluorescence, si les amorces portent une étiquette fluorescente, soit par autoradiographie si les amorces ont été marquées radioactivement. Les données de séquence résultantes peuvent ensuite être examinées pour déterminer la séquence de nucléotides du modèle d'ADN original.

En respectant ces étapes procédurales, le séquençage en cycle facilite le séquençage précis et efficace des fragments d'ADN. Cela en fait un atout technologique inestimable pour la recherche en biologie moléculaire, les pratiques diagnostiques et un éventail d'autres disciplines scientifiques.

Protocole de séquençage par cycles : Une procédure détaillée

Matériaux et Équipement

Avant de commencer le protocole de séquençage par cycles, rassemblez tous les matériaux et équipements nécessaires :

Matériaux :

Tampon de marquage : 300 mM Tris-HCl, pH 7,8, 50 mM MgCl2, 1 M KCl.

Tampon de dilution de kinase : 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM DTT, 0,1 mM ATP, 0,2 mg/mL BSA, 50 % glycérol.

Amorce de séquençage : Disponible dans le commerce, par exemple, 5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'.

ATP marqué : [γ-32P]ATP (≥ 3000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) ou [γ-33P]ATP (1600 Ci/mmol).

Tampon de séquençage : 300 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM MgCl2, 300 mM KCl, 0,5 % W-1.

Solution de teinture à base de formamide : 95 % de formamide déionisé, 10 mM d'EDTA, pH 8,0, 0,1 % de bleu de bromothymol, 0,1 % de cyanol de xylène.

Taq ADN polymérase, dNTPs et ddNTPs : Disponibles dans le commerce.

Tampon TE 10X : 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA.

Huile de silicone légère : Optionnelle.

Amorces PCR avec des queues universelles : par exemple, M13 avant (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3') et M13 arrière (5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3').

Équipement :

Cycler thermique : Capable d'exécuter un cycle thermique similaire à la PCR.

Bains d'eau ou blocs chauffants : Pour maintenir des températures spécifiques.

Tubes de microcentrifugeuse : Polypropylène, 0,2 ou 0,5 mL.

Pipettes automatiques : Capables de distribuer 0,5–20 µL et 10–100 µL.

Équipement d'électrophorèse : Pour Séquençage de l'ADN.

Film radiographique : Monocouche avec une base bleue.

Procédure

Étape 1 : Marquage des amorces

Diluez le primer de séquençage à 0,5 pmol/µL avec un tampon TE 1X.

Mélangez 2 µL du primer dilué, 1 µL de tampon de marquage, 2 pmol d'ATP marqué et 1 µL de kinase de polynucléotide T4 dans un tube de microcentrifugeuse.

Incubez la réaction à 37°C pendant 10 minutes, puis à 55°C pendant 5 minutes.

Placez le tube sur de la glace humide pour arrêter la réaction.

Étape 2 : Préparation des mélanges de réaction

Préparez un mélange de pré-réaction en combinant 5 µL de primer marqué en bout, 4,5 µL de tampon de séquençage, 7 à 26 µL d'ADN modèle, 0,5 µL de Taq ADN polymérase et de l'eau distillée autoclave jusqu'à un volume total de 36 µL.

Divisez le mélange de pré-réaction en quatre tubes de microcentrifugeuse étiquetés A, C, G et T.

Étape 3 : Séquençage des réactions

Préparez les mélanges de séquençage selon le Tableau 1.

Ajoutez 10 µL du mélange de séquençage approprié à chaque tube de microcentrifugeuse étiqueté.

Bouchonnez les tubes de manière sécurisée et mélangez doucement.

Si vous utilisez un cycler thermique sans couvercle chauffant, ajoutez 20 µL d'huile de silicone à chaque réaction.

Initier le cycle thermique avec le programme suivant :

3 minutes à 95°C pour la dénaturation.

20 cycles de dénaturation à 95°C pendant 30 s, d'hybridation à 55°C pendant 30 s, et d'extension à 70°C pendant 60 s.

10 cycles supplémentaires de dénaturation à 95°C pendant 30 s et d'extension à 70°C pendant 60 s.

Étape 4 : Analyse

Terminez les réactions en ajoutant 5 µL de solution de colorant au formamide à chaque tube.

Mélangez bien et centrifugez brièvement.

Conservez les tubes de réaction à -20°C jusqu'à l'analyse.

Séparez les produits de réaction sur un gel de séquençage et visualisez-les à l'aide d'un film radiographique.

Applications du séquençage de cycles

Recherche sur les maladies génétiques

Le séquençage par cycles est essentiel dans la recherche sur les maladies génétiques car il facilite la détermination précise des séquences d'ADN liées aux troubles héréditaires. Par exemple, Ng et al. (2010) ont utilisé le séquençage par cycles pour découvrir de nouvelles mutations au sein du gène PANK2, impliqué dans la neurodégénérescence associée à la kinase du pantothénate (PKAN), une maladie neurodégénérative rare. En séquençant les segments codants du gène PANK2 chez des sujets atteints, les chercheurs ont identifié des mutations de type missense qui entravaient la fonctionnalité des protéines, améliorant ainsi la compréhension des bases génétiques de la PKAN (Ng et al., 2010).

Microbiologie environnementale

Dans le domaine de la microbiologie environnementale, le séquençage en cycle constitue une méthode fondamentale pour délimiter les communautés microbiennes et leur répertoire de gènes fonctionnels au sein de divers écosystèmes. Par exemple, Liu et al. (2018) ont utilisé le séquençage en cycle des gènes 16S rRNA pour examiner la diversité et la composition microbienne dans des échantillons de sol provenant de différentes catégories d'utilisation des terres. Grâce au séquençage de fragments amplifiés par PCR des gènes 16S rRNA, les chercheurs ont discerné des modifications dans l'architecture des communautés microbiennes à travers différents modèles d'utilisation des terres, éclairant ainsi les répercussions des pratiques de gestion des terres sur les assemblages microbiens du sol (Liu et al., 2018).

Génomique du cancer

La technique de séquençage par cycles trouve son utilité dans le vaste domaine de la génomique du cancer, où elle est utilisée pour déceler des mutations somatiques et des altérations génomiques associées, essentielles à la tumorigenèse et à la progression subséquente. Cela est brillamment mis en évidence dans l'étude fondamentale réalisée par Imielinski et al. (2012), où l'application concertée du séquençage par cycles a révélé le panorama mutationnel de l'adénocarcinome pulmonaire. Grâce à un séquençage méthodique des échantillons d'ADN tumoral et normal correspondant, les chercheurs ont réussi à identifier des mutations récurrentes dans certains gènes, à savoir EGFR, KRAS et TP53. Cette révélation a fourni des indices importants concernant les mécanismes moléculaires qui influencent la pathogénie du cancer du poumon (Imielinski et al., 2012).

Analyse judiciaire

Dans la science judiciaire, le séquençage en cycle est une technique fondamentale pour le profilage ADN et l'analyse judiciaire, permettant l'identification des individus par leurs signatures génétiques. Par exemple, Budowle et al. (2003) ont utilisé le séquençage en cycle pour examiner les loci de répétitions en tandem courtes (STR) pour le profilage ADN judiciaire. En séquençant des fragments d'ADN amplifiés par PCR extraits à la fois des preuves de la scène de crime et des échantillons de référence, les chercheurs ont réussi à faire correspondre des profils ADN, contribuant ainsi de manière significative aux enquêtes criminelles et à l'administration de la justice (Budowle et al., 2003).

L'utilité du séquençage par cycles s'étend à divers domaines, englobant un éventail d'efforts de recherche biologique et d'applications concrètes. De la découverte des bases génétiques des maladies à la délimitation des communautés microbiennes et au profilage de l'ADN judiciaire, le séquençage par cycles émerge comme un instrument polyvalent pour générer des informations précises sur les séquences d'ADN. Ses applications multifacettes contribuent de manière significative à l'avancement des connaissances en génétique, microbiologie, oncologie et sciences judiciaires, enrichissant ainsi notre compréhension de ces domaines scientifiques complexes.

Élargissement des offres de services : Intégration du séquençage Sanger et du séquençage de nouvelle génération

En explorant les subtilités de la contribution du séquençage par cycles à l'analyse génétique, il est impératif de contextualiser son importance dans le paysage des méthodologies de séquençage. Bien que le séquençage par cycles serve de méthode fondamentale, offrant une analyse de l'ADN méticuleuse et rapide, son efficacité est augmentée et harmonisée par les fonctionnalités inhérentes à la fois. Séquençage de Sanger et Séquençage de nouvelle génération (NGS).

Séquençage Sanger : Une fondation de la précision

Séquençage de Sanger, crédité au travail pionnier de Frederick Sanger, demeure comme la méthode quintessentielle dans Séquençage de l'ADN en raison de son explication méticuleuse des séquences de nucléotides. En utilisant la terminaison stratégique de la synthèse de l'ADN grâce à des ddNTPs terminant la chaîne, le séquençage de Sanger permet aux chercheurs de discerner les séquences génétiques avec une précision inégalée. Sa méthodologie ciblée s'avère particulièrement avantageuse dans la validation des variants génétiques et le séquençage de régions désignées avec une fidélité maximale.

Séquençage de nouvelle génération : Révolutionner l'analyse génétique

À la pointe de la génomique à haut débit, NGS Les technologies ont révolutionné notre méthodologie en analyse génétique. Grâce à la parallélisation des réactions de séquençage et à l'utilisation de plateformes novatrices, le séquençage de nouvelle génération (NGS) facilite une élucidation génomique rapide et exhaustive à une échelle auparavant inconcevable avec les techniques de séquençage conventionnelles. Allant du séquençage de génome entier à la métagénomique et à la transcriptomique, le NGS permet aux chercheurs d'explorer les complexités du génome avec une profondeur et une portée sans précédent.

Intégration dans les offres de services

En accord avec notre engagement envers une enquête approfondie par séquençage cyclique, notre établissement élargit désormais son champ d'action pour inclure Séquençage de Sanger et NGSCette stratégie holistique garantit aux chercheurs un accès à un répertoire varié de méthodologies de séquençage, chacune dotée de capacités et d'utilités distinctes. Que ce soit pour déchiffrer les bases génétiques des maladies, caractériser des populations microbiennes ou profiler l'ADN judiciaire, notre portefeuille de services amélioré équipe les chercheurs des outils et de l'expertise nécessaires pour naviguer habilement dans les complexités de l'analyse génétique.

Références :

1. Ng, J., Papandreou, A., Heales, S. J., Kurian, M. A. (2010). Troubles des neurotransmetteurs monoamines - Avancées cliniques et perspectives futures. Nature Reviews Neurologie, 6(12), 705-715.
2. Liu, J., Sui, Y., Yu, Z., Shi, Y., Chu, H., Jin, J., ... & Wang, G. (2018). Le contenu en carbone du sol influence la distribution biogéographique des communautés fongiques dans la zone de sol noir du nord-est de la Chine. Biologie et biochimie des sols, 121, 103-108.
3. Imielinski, M., Berger, A. H., Hammerman, P. S., Hernandez, B., Pugh, T. J., Hodis, E., ... & Garraway, L. A. (2012). Cartographie des caractéristiques de l'adénocarcinome pulmonaire par séquençage massif parallèle. Cellule, 150(6), 1107-1120.
4. Budowle, B., Moretti, T. R., Baumstark, A. L., Defenbaugh, D. A., Keys, K. M., & Brown, A. L. (2003). Validation des répétitions en tandem courtes (STR) pour une utilisation judiciaire : Test de performance des systèmes STR multiplex fluorescents et analyse d'échantillons judiciaires authentiques et simulés. Journal des sciences judiciaires, 48(4), 928-956.
5. Blakesley, R.W. (2001). Séquençage de cycles. Dans : Graham, C.A., Hill, A.J.M. (éds) Protocoles de séquençage de l'ADN. Méthodes en biologie moléculaire
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