Contrôle de qualité de la bibliothèque de séquençage ATAC

ATAC-seq (Assay pour le ciblage de la chromatine accessible avec séquençage à haut débit) est une technique puissante qui exploite les propriétés de transposition de l'enzyme Tn5 pour étudier la chromatine ouverte, l'empreinte des facteurs de transcription et la localisation des nucléosomes. Cependant, en raison du temps et des coûts considérables impliqués dans le séquençage, les chercheurs et les entreprises de séquençage effectuent souvent des contrôles de qualité pré-séquencement sur les bibliothèques construites. Ces contrôles englobent divers paramètres, tels que la concentration de la bibliothèque et la taille des fragments, afin d'assurer des résultats fiables et significatifs.

Lectures recommandées : ATAC-Seq – Une méthode pour étudier la chromatine ouverte.

Comparé à d'autres bibliothèques de séquençage, ATAC-seq Les bibliothèques posent des défis uniques en matière d'évaluation de la qualité. L'incertitude provient des variations potentielles entre les types d'échantillons et les prétraitements, qui peuvent avoir un impact significatif sur la qualité des bibliothèques générées.

Les bibliothèques ATAC-seq sont généralement préparées à partir de noyaux ou de cellules intacts, où le transposon pénètre dans la membrane nucléaire ou cellulaire pour accéder à l'intérieur de la chromatine. La réaction de transposition incorpore ensuite des séquences de jonction de séquençage dans l'ADN fragmenté. Cependant, l'accessibilité de la chromatine peut être influencée par plusieurs facteurs, y compris le type de cellule, le nombre de cellules, l'activité cellulaire, le regroupement cellulaire et la concentration relative du transposon par rapport à l'ADN. En conséquence, le nombre et la taille des fragments de bibliothèque peuvent présenter une variabilité considérable.

Profil typique de TapeStation (TapeStation D1000 dans ce cas) d'une bibliothèque ATAC-seq. (Maor-Nof et al., 2021)

Pour relever ces défis et garantir des données fiables, des mesures de contrôle de qualité complètes sont indispensables. Les chercheurs évaluent minutieusement la concentration de la bibliothèque et la distribution de la taille des fragments pour optimiser les efforts de séquençage. De plus, comprendre les caractéristiques spécifiques de chaque échantillon et tenir compte des variations potentielles peut aider à interpréter les données résultantes avec précision.

Analyse de la taille des fragments pour les bibliothèques ATAC-Seq

Pour une évaluation complète des bibliothèques ATAC-Seq, il est essentiel d'analyser la distribution des fragments d'ADN après l'amplification de la bibliothèque. Nous recommandons vivement d'utiliser un analyseur de fragments d'ADN pour accomplir cette tâche. En générant un électrophorogramme des fragments, les chercheurs peuvent obtenir des informations précieuses sur les tailles des fragments et leurs formes de pics. Pour garantir des résultats précis, il est conseillé d'utiliser un essai avec une résolution inférieure à 1000 paires de bases (pb).

L'analyse de la taille des fragments fournit des informations essentielles sur l'intégrité et l'efficacité de la bibliothèque. Un pic bien défini et concentré dans l'électrophorogramme signifie une distribution homogène des fragments d'ADN dans la plage souhaitée. En revanche, des formes de pic irrégulières ou des distributions de taille larges peuvent indiquer des problèmes potentiels avec la préparation ou l'amplification de la bibliothèque.

En réalisant cette analyse, les chercheurs peuvent évaluer avec confiance le succès de la Préparation de bibliothèque ATAC-Seq et prendre des décisions éclairées concernant la stratégie de séquençage. En fin de compte, cette étape contribue de manière significative à la fiabilité et à la qualité des données générées, conduisant à des interprétations plus précises de l'accessibilité de la chromatine et du cartographie des éléments régulateurs.

Contrôle de qualité des bibliothèques ATAC-Seq

L'unité fondamentale de la chromatine eucaryote est le nucléosome, composé de 147 paires de bases (pb) d'ADN enroulées autour d'un octamère d'histones, reliées par des jonctions d'ADN de 20 à 90 pb. La compacité de la chromatine, déterminée par son interaction avec les histones, joue un rôle crucial dans la régulation de l'expression génique.

Dans les régions de chromatine ouverte, où l'ADN interagit faiblement avec les histones, les promoteurs et les activateurs de transcription peuvent facilement se lier à l'ADN, facilitant ainsi la transcription. En revanche, dans les régions de chromatine fermée avec un lien étroit entre l'ADN et les histones, les facteurs de transcription ont du mal à accéder aux régions promoteurs et aux activateurs, inhibant ainsi la transcription.

L'ATAC-Seq tire parti de la capacité de l'enzyme Tn5 modifiée à accéder aux régions de chromatine ouverte, clivant l'ADN en fragments tout en ajoutant les séquences d'adaptateurs nécessaires pour le séquençage. Le processus de transposition peut se produire à diverses régions de jonction entre les nucléosomes, résultant en de courts fragments (<90 pb) ou de plus grands fragments avec des nucléosomes coincés entre l'ADN coupé par Tn5.

Après amplification de la bibliothèque et ajout des index Illumina, les fragments de la bibliothèque varient généralement d'environ 200 pb à 1000 pb. Des pics entre 160 et 200 pb apparaissent en raison de la périodicité des nucléosomes voisins.

La taille et la forme des fragments de bibliothèque ATAC-Seq peuvent varier considérablement entre les échantillons en raison des différences de types cellulaires, de statut d'activité, de nombre de cellules et de traitement des échantillons. Cette variabilité dépend des caractéristiques spécifiques aux cellules et du rapport entre les transposons et l'ADN.

La variation des pics de nucléosomes est influencée par la fréquence de clivage de l'ADN par Tn5, mais le nombre ou la taille des pics ne corrèle pas toujours directement avec la qualité des données de séquençage. Les formes des pics de la bibliothèque ressemblent souvent à une pente de ski plutôt qu'à des pics distincts.

Cependant, le facteur le plus critique pour les bibliothèques est de présenter une bonne distribution des fragments dans la plage de 200 à 1000 pb, de préférence en dessous de 600 pb. Cette caractéristique garantit la capture d'informations essentielles sur l'accessibilité de la chromatine et améliore la fiabilité des données ATAC-Seq.

Optimisation de la réaction de transposition pour une préparation efficace de bibliothèques ATAC-Seq

La réaction de transposition est une étape cruciale dans la préparation de la bibliothèque ATAC-Seq qui implique l'ajout de l'enzyme Tn5 pour accéder à la chromatine et cliver l'ADN en fragments. Cependant, une quantité insuffisante de Tn5 ou un faible ratio Tn5/ADN peuvent entraîner une transposition inadéquate, résultant en une sous-tagmentation. Ce phénomène se caractérise par des fragments d'ADN majeurs concentrés autour de 800 bp.

De grands fragments présentent plusieurs inconvénients, tels qu'un regroupement inefficace sur les cellules de flux, entraînant une densité de regroupement plus faible et une réduction du rendement de séquençage. Pour atteindre la couverture souhaitée, un plus grand nombre de séquençages est nécessaire pour les grands fragments par rapport aux plus petits.

L'under-tagmentation peut résulter de divers facteurs, la préparation inadéquate des noyaux étant une cause fréquente. Obtenir des noyaux bien séparés et en suspension à partir d'échantillons de tissu est plus difficile que de les obtenir à partir de cellules cultivées, rendant l'under-tagmentation plus répandue dans les échantillons de tissu.

Pour résoudre les problèmes de sous-tagging, les suggestions suivantes peuvent être utiles :

• Assurez-vous d'une résuspension complète dans le tampon de lyse et homogénéisez les échantillons de tissu pour une préparation optimale des noyaux.
• Prolongez le temps de lyse cellulaire sur glace pour améliorer l'activité de Tn5.
• Augmentez le temps de réaction de la transposase pour favoriser une coupure efficace.
• Ajoutez un lavage supplémentaire avec du PBS avant la lyse pour éliminer les inhibiteurs potentiels de la lyse dans l'échantillon.

Une autre cause de fragments d'ADN surdimensionnés pourrait être la mauvaise qualité de l'échantillon, en particulier lorsque des cellules mortes libèrent des quantités excessives d'ADN libre dans la suspension cellulaire. Cet excès d'ADN peut saturer l'activité de Tn5, réduisant ainsi son interaction avec l'ADN chromatinien.

Pour éviter ce problème, il est recommandé d'utiliser des cellules fraîches avec une haute activité ou des cellules congelées dans une solution de 50 % de FBS, 40 % de milieu de culture et 10 % de DMSO. Pour les échantillons de tissu, le congélation rapide dans de l'azote liquide et le stockage à -80℃ sont essentiels pour préserver la qualité de l'échantillon. Les expériences doivent être réalisées rapidement, et le tissu ne doit pas être autorisé à dégeler avant d'être haché dans une boîte de pétri sur de la glace.

Dans les cas où des cellules triées par FACS sont utilisées, il convient de faire preuve de prudence pour minimiser les dommages cellulaires pendant le processus de tri. Utilisez des techniques de tri optimisées pour réduire les dommages et visez à commencer avec le plus grand nombre de cellules possible. De plus, trier des populations cellulaires rares avec moins de 10 % d'occupation peut causer plus de dommages que de trier des cellules avec une forte occupation (par exemple, 70 %).

En plus des précautions mentionnées, une manipulation expérimentale précise et une attention aux détails durant le processus expérimental sont essentielles pour minimiser les erreurs inter-échantillons.

Rendements de bibliothèque ATAC-Seq

Lorsqu'on commence avec 50 000 à 100 000 cellules fraîches, un rendement idéal de 400 à 600 ng peut être atteint. Ce rendement est obtenu dans un volume d'élution final de 20 μL, avec une concentration d'environ 20 à 30 ng/μL.

Cependant, il est important de noter que les cellules triées par FACS peuvent produire des quantités inférieures d'ADN en raison des dommages cellulaires survenant pendant le processus de tri. De plus, si c'est la première fois que vous essayez l'expérience ATAC-Seq, le manque de familiarité avec les étapes peut entraîner une perte d'ADN lors des opérations expérimentales.

Pour minimiser la perte d'échantillons, en particulier lors de l'utilisation de billes magnétiques SPRI, une approche douce est essentielle. L'éthanol doit être ajouté délicatement au fond du tube, permettant à celui-ci de remonter lentement sans perturber les billes magnétiques. Il convient d'éviter de trop sécher les billes, car cela peut entraîner leur rupture et une perte d'échantillon significative. Lors de la purification de l'ADN par colonne, ajouter le tampon d'élution au centre de la colonne garantit une récupération efficace de l'ADN.

Pour les expériences ATAC-Seq, des quantités relativement petites d'ADN sont nécessaires pour le séquençage. Par conséquent, bien que le rendement soit important, il n'est pas nécessaire de s'y concentrer excessivement. Tant qu'il y a suffisamment d'ADN pour le séquençage et que les fragments de la bibliothèque semblent satisfaisants, les bibliothèques peuvent être séquencées.

Variabilité dans la bibliothèque ATAC-Seq

Il est courant d'observer des différences dans les formes de pics parmi les fragments de bibliothèque ATAC-Seq provenant de divers échantillons expérimentaux et même entre différents lots du processus de préparation de la bibliothèque. Ces variations peuvent survenir en raison de facteurs tels que le nombre de cellules utilisées, les conditions de lyse cellulaire ou d'autres différences subtiles qui influencent la fréquence de clivage de Tn5 ou pA-Tn5.

Malgré de telles variations dans la fréquence de clivage et les différences résultantes dans l'apparence des fragments de bibliothèque, la qualité des données de séquençage peut rester stable et fiable à travers ces échantillons. Cette stabilité est principalement due au fait que les pics de données sont largement régis par l'accessibilité de Tn5 à la chromatine ouverte ou pA-Tn5 aux anticorps.

Bien que l'apparence des pics de la bibliothèque puisse servir d'indicateur qualitatif pour décider de poursuivre avec le séquençage, il est essentiel de comprendre que la qualité de la bibliothèque à elle seule ne garantit pas le succès du séquençage. Cependant, les résultats du contrôle de qualité (CQ) de la bibliothèque peuvent fournir des informations précieuses sur la probabilité de succès du séquençage et offrir des opportunités d'optimisation des processus en fonction des résultats du CQ.

Pour garantir une quantification précise de la bibliothèque, des tests basés sur la qPCR devraient être utilisés. Cette étape renforce encore la confiance dans l'adéquation de la bibliothèque pour le séquençage et facilite des décisions éclairées dans le flux de travail de séquençage.

En conclusion, comprendre la variabilité des pics de fragments de bibliothèque ATAC-Seq est crucial pour interpréter efficacement les résultats de séquençage. Bien que l'apparition des pics puisse guider le processus de prise de décision, un contrôle qualité complet de la bibliothèque, associé à une quantification basée sur la qPCR, contribue à la réussite des expériences ATAC-Seq et à la génération d'insights épigénétiques significatifs.

Référence:

1. Beck, Daniel, Millissia Ben Maamar, et Michael K. Skinner. "Comparaison des méthodes d'analyse de la densité de CpG à l'échelle du génome et de la méthylation de l'ADN (MeDIP, RRBS et WGBS)." Épigénétique 17,5 (2022) : 518-530.