Séquençage de nouvelle génération (NGS) vs. PCR

Qu'est-ce que la PCR ?

La PCR, abréviation de réaction en chaîne par polymérase, constitue un outil essentiel pour détecter des mutations connues. Elle fonctionne en identifiant des fragments d'ADN spécifiques, permettant ainsi de déterminer si un gène a subi une mutation. Cette technique imite le processus naturel de réplication de l'ADN, mais dans un environnement contrôlé en laboratoire. Au fil du temps, la PCR a évolué, donnant naissance à diverses itérations pour s'adapter à des applications variées.

La première génération de PCR, connue sous le nom de PCR qualitative, utilise des instruments de PCR standard pour amplifier les gènes cibles. L'analyse ultérieure implique une électrophorèse sur gel d'agarose pour examiner le produit obtenu.

Faisant progresser le domaine, la deuxième génération introduit la PCR quantitative fluorescente (qPCR). Cette technique permet le suivi en temps réel des produits d'amplification en incorporant des réactifs fluorescents. Malgré sa capacité de quantification relative utilisant des courbes standard, la qPCR ne parvient pas à fournir une quantification absolue.

Une autre avancée notable est le Système de Blocage d'Amplification de Mutation (ARMS), qui utilise des amorces spécifiques pour amplifier avec précision des séquences cibles mutantes. Associé à la détection par sonde et à la PCR quantitative en temps réel par fluorescence, l'ARMS permet la détection de mutations rares avec une spécificité et une sensibilité accrues. Cependant, son champ d'application est limité aux types de mutations connus, ce qui le rend incapable d'identifier des mutations nouvelles.

Principes et procédures de la PCR

Le processus de PCR comprend plusieurs composants fondamentaux :

• Modèle d'ADN : Cela fait référence à l'ADN échantillon contenant la séquence cible.
• Polymérase ADN : Utilisée pour synthétiser un nouveau brin d'ADN complémentaire à la séquence cible. Les polymérases couramment utilisées incluent la polymérase ADN Taq.
• Nucléotides : Ce sont les éléments de base, spécifiquement les désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP) (A/T/C/G), essentiels pour la construction du nouveau brin d'ADN.
• Transcriptase inverse : Dans la PCR par transcription inverse (RT-PCR), la transcriptase inverse est cruciale pour convertir l'ARN de l'échantillon en ADN complémentaire (ADNc).

Séquençage de Sanger

Séquençage de Sanger se distingue par sa capacité à identifier directement à la fois les mutations connues et inconnues, ce qui en fait un atout précieux dans l'analyse génétique. Cependant, sa sensibilité est remarquablement limitée en ce qui concerne la détection des mutations au sein du gène EGFR.

Cette méthode consiste à lire séquentiellement les bases d'ADN sur une longueur d'environ 800 paires de bases, lui conférant le statut de norme d'or tant dans le séquençage traditionnel que dans le séquençage de nouvelle génération. Notamment, le séquençage de Sanger a joué un rôle essentiel dans l'achèvement du projet révolutionnaire du génome humain, qui a duré plus de 13 ans.

En pratique, le séquençage Sanger implique la conception d'amorces ciblant des sites de mutation au sein de gènes associés à des maladies connues, suivie d'une amplification par PCR pour un séquençage direct. Contrairement à l'amplification complète des exons, seule la région spécifique de mutation ou une partie voisine de l'exon nécessite une amplification. Malgré son utilité, la sensibilité du séquençage Sanger est limitée ; il peut ne pas détecter des mutations se produisant à des fréquences inférieures à 5 %.

Séquençage de nouvelle génération (NGS)

NGS, ou Séquençage de nouvelle générationoffre une puissance exploratoire remarquable, générant d'énormes quantités de données à partir d'un seul point de départ en ADN, permettant ainsi un débit d'échantillons plus élevé. Cette technologie de séquençage de l'ADN, qui s'appuie sur les méthodologies PCR et GeneChip, représente une avancée significative par rapport aux techniques de séquençage traditionnelles.

Alors que le séquençage de première génération utilisait le séquençage par terminaison synthétique, le NGS introduit des terminaisons de terminaison réversibles, permettant le séquençage simultanément à la synthèse. Le NGS fonctionne en capturant des étiquettes spécifiques, généralement des marqueurs moléculaires fluorescents, portés par les bases nouvellement ajoutées lors de la réplication de l'ADN pour déterminer la séquence de l'ADN.

Également appelé séquençage parallèle massif (MPS) ou séquençage à haut débit (HTS), le NGS se distingue par sa scalabilité, sa rapidité et son accessibilité dans l'analyse des séquences génomiques ou de nucléotides partiels. Il a la capacité de séquencer des millions, voire des milliards de molécules d'ADN simultanément, révolutionnant ainsi les efforts de séquençage à grande échelle.

NGS englobe deux types principaux : le séquençage à lecture courte et séquençage à lecture longueLe séquençage à lecture courte, caractérisé par sa maturité en précision et en rapport coût-efficacité, est largement utilisé dans la recherche fondamentale et les applications cliniques. En revanche, le séquençage à lecture longue, bien qu'il soit encore en cours d'optimisation en termes de précision et de coût, répond aux limitations du séquençage à lecture courte dans la détection des variations structurelles dans de grands fragments.

Les avantages du NGS incluent sa capacité à amplifier l'ADN grâce à des réactions de PCR à l'échelle nanométrique, entraînant une génération massive de données par des réactions parallèles. La diminution du coût de la génération de données a démocratisé le séquençage génétique à grande échelle, facilitant la recherche à l'échelle des populations et améliorant les applications dans le diagnostic clinique, la découverte de médicaments et le traçage des agents pathogènes.

Tableau 1 NGS vs. PCR

De plus, des avancées telles que La technologie SMRT de PacBio et Séquençage par nanopore d'ONT ont des capacités NGS élargies. La technologie de PacBio facilite l'assemblage de novo d'espèces complexes, favorisant les études sur la biodiversité, tandis que le séquençage Nanopore d'ONT, avec son approche indépendante de la PCR et ses longues lectures dépassant 4 Mb, améliore la détection des variantes structurelles. Portable NGS Les dispositifs étendent les applications de séquençage des laboratoires aux environnements de terrain et même dans l'espace, élargissant ainsi le champ de la recherche génomique et de ses applications pratiques.

Choisir entre NGS et qPCR : facteurs et considérations

Déterminer s'il faut utiliser NGS La qPCR dépend de plusieurs facteurs, notamment la taille de l'échantillon, l'étendue des séquences dans la région cible, les contraintes budgétaires et les objectifs de l'étude. La qPCR s'avère généralement avantageuse lorsqu'il s'agit d'un nombre limité de régions cibles (≤20) et lorsque l'étude vise à dépister ou identifier des variants connus. En revanche, le NGS se révèle être le choix privilégié dans la plupart des autres scénarios.

Contrairement aux approches de test itératives traditionnelles, le séquençage NGS ciblé rationalise les processus en permettant le séquençage simultané de plusieurs gènes à travers de nombreux échantillons. De plus, NGS offre des capacités d'exploration supérieures, facilitant la détection de nouvelles variantes. Ainsi, c'est souvent la méthode de choix pour les études nécessitant des aperçus génomiques plus larges ou des projets de séquençage à grande échelle.