Données de séquençage métagénomique : Guide étape par étape de la vérification de la qualité aux insights

Introduction

Séquençage métagénomique L'analyse des données révèle des histoires cachées sur des écosystèmes microbiens complexes. En suivant un flux de travail d'analyse métagénomique clair, les chercheurs peuvent transformer des lectures brutes en connaissances exploitables, découvrant de nouvelles espèces, suivant des gènes de résistance aux antibiotiques et cartographiant des réseaux métaboliques. Ce guide vous accompagne à travers chaque point de contrôle essentiel :

• Vérifications de l'intégrité des données pour confirmer l'exhaustivité des fichiers
• Contrôle de la qualité et élimination de l'ADN hôte pour des résultats en aval plus propres
• Stratégies d'assemblage et de regroupement qui construisent des contigs et des MAGs
• Prédiction des gènes, calcul d'abondance et annotation pour un aperçu fonctionnel
• Tests statistiques et visualisation révélant un sens biologique

Que vous étudiiez les microbiomes intestinaux humains ou les sédiments des profondeurs marines, les conseils étape par étape ci-dessous renforceront votre analyse des données de séquençage métagénomique du début à la fin.

1 Évaluation de l'intégrité des données

La phase de validation préliminaire comprend la vérification de la taille des fichiers, la décompression réussie et l'absence de corruption des caractères. Un hachage cryptographique avec md5sum est ensuite appliqué pour confirmer la fidélité au niveau des octets des archives de séquençage.

2 Prétraitement des données

Les pipelines métagénomiques suivent généralement deux trajectoires principales. La première assemble des lectures courtes en contigs pour la prédiction de gènes en aval et l'interrogation fonctionnelle. La seconde construit des génomes assemblés de métagénomes (MAGs) par binning, suivie d'un profilage taxonomique et d'une analyse différentielle des gènes fonctionnels (Figure 1).

Figure 1. Bref processus d'analyse métagénomique.

2.1 Contrôle de la qualité

Les lectures brutes Illumina (FASTQ) contiennent souvent des séquences d'adaptateurs et des bases de faible qualité. La visualisation de la qualité des lectures est effectuée avec FastQC (Andrews 2010), tandis que Trimmomatic intégré dans KneadData supprime les adaptateurs et taille les nucléotides de qualité inférieure (Bolger et al. 2014). Avant le traitement, les fichiers en paire sont renommés avec les suffixes "_1" et "_2" pour garantir la compatibilité avec le logiciel. MultiQC agrège les métriques de qualité à travers plusieurs échantillons dans un rapport unifié (Ewels et al. 2016). Les bibliothèques sont généralement acceptées lorsque ≥85 % des bases présentent des scores Phred ≥30 (Q30) et lorsque la teneur en GC se situe dans la plage attendue.

2.2 Suppression de la séquence hôte

Les échantillons provenant d'environnements associés à un hôte contiennent souvent de l'ADN d'hôte qui diminue le signal microbien. Les génomes de référence obtenus à partir des Ensembl Genomes sont indexés, et les lectures sont alignées avec Bowtie2, BWA, KneadData ou Kraken2 pour éliminer les séquences d'hôte (Langmead et al. 2009 ; Li et Durbin 2009 ; Wood et al. 2019). Les tests de référence indiquent que Kraken2 offre une vitesse de traitement supérieure et une consommation de ressources réduite (Gao et al. 2025) (Figure 2). Une évaluation secondaire avec FastQC confirme l'amélioration. Dans une étude représentative, l'alignement de Bowtie2 au génome de référence humain (GRCh38) a éliminé 98 % des lectures d'hôte, augmentant la sensibilité de détection de Clostridioides difficile de 50 % à 90 % et améliorant considérablement le profilage des gènes de résistance aux antimicrobiens (Kok et al. 2022).

Figure 2. Utilisation de la mémoire (diagonale en haut à droite) et temps d'exécution (diagonale en bas à gauche) parmi différents logiciels (Gao et al. 2025).

Assemblage et regroupement de séquences

3.1 Assemblage de novo

Les bibliothèques de courtes lectures sont converties en séquences contiguës (contigs) avec MEGAHIT (Li et al., 2015) ou metaSPAdes (Bankevich et al., 2012). La longueur des K-mers, généralement un entier impair, exerce un effet déterminant sur l'efficacité et la précision de l'assemblage ; des valeurs optimales peuvent être inférées avec KmerGenie (Chikhi et Medvedev, 2014). metaSPAdes produit des contigs d'une fidélité supérieure bien qu'à un coût computationnel plus élevé, ce qui le rend adapté aux projets à échantillon unique, tandis que MEGAHIT permet un co-assemblage rapide à travers plusieurs échantillons. Pour un ensemble de données de sol de 252 Go, MEGAHIT accéléré par GPU a conclu l'assemblage en 44,1 h, triplant le N50 et la longueur moyenne des contigs par rapport aux méthodes conventionnelles et élevant le taux de mappage des lectures à 55,8 % - une amélioration quadruple (Li et al., 2015). Des valeurs N50 accrues reflètent une meilleure continuité de l'assemblage.

3.2 Regroupement et Reconstruction du Génome

Les contigs assemblés sont regroupés en génomes assemblés à partir de métagénomes (MAGs) via MetaBAT 2 (Kang et al., 2019) ou des algorithmes similaires. Les résultats de MaxBin 2, MetaBAT 2 et CONCOCT sont régulièrement intégrés dans le flux de travail MetaWRAP (Uritskiy et al., 2018). Le module bin_refinement réassemble les génomes préliminaires tout en respectant les seuils de complétude et de contamination définis par l'utilisateur ; quant_bins cartographie ensuite les lectures d'échantillon à chaque bin pour quantifier l'abondance relative. L'application de ce protocole à la microbiote de soja fermenté cambodgien (Sieng) a donné six MAGs de haute qualité (Tamang et al., 2023), tandis qu'une enquête séparée a déreplicé 126 MAGs en 58 ensembles de données génomiques non redondants (Banchi et al., 2023) (Figure 3).

Figure 3. Une étude a construit 58 ensembles de données génomiques non redondants à partir de 126 génomes d'assemblage métagénomique (MAGs). (Banchi et al. 2023)

4 Prédiction des gènes et élimination des redondances

Les cadres de lecture ouverts et les ARN non codants sont annotés avec Prokka (paramètre --metagenome), qui intègre Prodigal et Infernal pour dériver les séquences protéiques correspondantes (Seemann 2014). Les fichiers fasta résultants peuvent être davantage curés avec SeqKit. Les peptides de signal sont inférés avec SignalP 6.0, tandis que les hélices transmembranaires - et, par extension, les protéines sécrétées - sont détectées avec TMHMM.

Pour atténuer l'inflation causée par des séquences très similaires, les protéines prédites sont regroupées avec CD-HIT ou MMseqs2, générant ainsi un catalogue de gènes non redondants (ensemble Unigene) adapté aux analyses quantitatives et fonctionnelles (Fu et al. 2012 ; Steinegger et Söding 2017). Les seuils de similarité sont ajustés en fonction des objectifs du projet. Cette stratégie a permis la récupération et l'annotation fonctionnelle des gènes dérivés du métagénome à partir des sédiments de la lagune de Venise (Figure 4 ; étude sur la biosciences marines et la technologie).

Figure 4. Carte thermique des clusters de gènes biosynthétiques (BGC) détectés dans l'ensemble de données MAG (Banchi et al. 2023).

5 Quantification de l'abondance des gènes

Le profilage de l'abondance des gènes fournit des estimations relatives ou absolues de loci spécifiques au sein de consortiums microbiens et, par conséquent, infère la capacité métabolique de la communauté. Deux stratégies largement adoptées sont résumées ci-dessous.

Le profilage de l'abondance des gènes fournit des estimations relatives ou absolues de loci spécifiques au sein de consortiums microbiaux et, par conséquent, infère la capacité métabolique de la communauté. Deux stratégies largement adoptées sont résumées ci-dessous.

• Stratégie de cartographie de lecture. Les lectures de séquençage sont alignées à un catalogue de gènes non redondant (Unigenes) avec BWA ou Bowtie 2. La couverture par gène est ensuite calculée avec CoverM et normalisée en transcripts par million (TPM), lectures par kilobase par million (RPKM) ou comptes non normalisés (Mortazavi et al., 2008 ; Corchete et al., 2020). Le TPM permet une comparaison robuste entre les échantillons, tandis que le RPKM reste préférable pour les bibliothèques à extrémité unique.
• Stratégie basée sur les k-mers. L'estimation sans alignement est effectuée avec Salmon, qui dérive l'abondance directement à partir des fréquences de k-mers, réduisant ainsi la charge computationnelle.

6 Annotation taxonomique et fonctionnelle

6.1 Profilage Taxonomique

La reconstruction taxonomique élucide la composition des communautés et facilite la découverte de nouveaux taxa. Trois algorithmes complémentaires sont régulièrement utilisés :

• Kraken 2 classe les lectures par hachage de k-mers et atteint une haute sensibilité, en particulier pour les organismes de faible abondance, bien qu'un taux de faux positifs élevé ait été signalé.
• MetaPhlAn 4 exploite des gènes marqueurs spécifiques à des clades pour fournir une précision au niveau des espèces, mais il peut négliger les taxons dépourvus de marqueurs canoniques.
• GTDB-Tk identifie des gènes marqueurs universels, génère des alignements de séquences multiples et effectue un placement phylogénomique, offrant ainsi une classification affinée des lignées précédemment non décrites (Chaumeil et al., 2020 ; Manghi et al., 2023).

Dans les flux de travail standard, MetaPhlAn 4 fournit le profil taxonomique de base ; Kraken 2 augmente la détection des espèces rares ; et GTDB-Tk résout les clades ambigus ou nouveaux. Les attributions critiques sont vérifiées manuellement avec des recherches BLAST. La structure de la communauté et les relations phylogénétiques pour la présente étude sont illustrées dans les Figures 5 et 6.

Figure 5. Profil taxonomique du composant Ascomycota dans les échantillons basé sur un graphique Krona (Tedersoo et al. 2021).

Figure 6. Arbre phylogénétique des MAGs reconstruit à partir des sédiments de la lagune de Venise, basé sur un alignement concaténé de 43 gènes marqueurs conservés. (Banchi et al. 2023)

6.2 Annotation fonctionnelle

La prédiction fonctionnelle initiale des génomes assemblés à partir de métagénomes (MAGs) a été réalisée avec Prokka, qui intègre Prodigal et Infernal pour l'annotation des cadres de lecture ouverts et des ARN. Des groupes orthologues ont ensuite été attribués avec eggNOG-mapper contre la base de données eggNOG (Huerta-Cepas et al.). Des analyses spécifiques à des domaines ont été entreprises conformément aux objectifs de l'étude : reconstruction de voies métaboliques avec KofamKOALA ; identification des enzymes actives sur les glucides via le référentiel CAZy ; classification des protéases avec la base de données MEROPS ; détection de gènes de résistance antimicrobienne à l'aide d'AMRFinderPlus ; et prédiction du potentiel métabolique de la communauté avec HUMAnN 3 (Aramaki et al., 2020 ; Beghini et al., 2021).

Le pipeline d'annotation concaténé a permis l'inférence des gènes de cycle du carbone, de l'azote et du soufre, ainsi que des clusters de gènes biosynthétiques, au sein des MAGs de sédiments de la lagune de Venise (Figure 7 ; Banchi et al., 2023).

Figure 7. Carte thermique montrant le potentiel métabolique des MAGs basé sur la présence de gènes clés et de voies métaboliques (Banchi et al. 2023).

7 Analyse et visualisation des données

7.1 Évaluation Statistique de l'Abondance des Gènes

Une matrice d'abondance génique, normalisée en tant que transcripts par million (TPM) ou en comptes bruts, a été compilée pour l'analyse de l'expression différentielle. Les caractéristiques à faible abondance et les effets de lot ont été filtrés avant l'inférence. Les gènes différentiels ont été identifiés avec DESeq2 dans R, en appliquant un P ajusté < 0,05 et |log₂ fold-change| > 1. Une sélection de caractéristiques supplémentaire a utilisé la taille de l'effet de l'analyse discriminante linéaire (LEfSe ; score LDA > 2) et la classification par forêt aléatoire. Lorsque des modèles d'apprentissage automatique ont été mis en œuvre, les biomarqueurs candidats présentant une aire sous la courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur (AUC) > 0,70 ont été jugés informatifs.

7.2 Analyses et visualisation complémentaires

La cartographie des associations de réseaux, le traçage des gènes différentiels et l'évaluation des séries temporelles ont été réalisés selon les besoins. Les facteurs environnementaux influençant la structure des communautés ont été interrogés à l'aide d'une analyse d'ordination contrainte - analyse de correspondance canonique (CCA) ou analyse de redondance (RDA) - en utilisant le package vegan dans R. Les ordinations résultantes ont été rendues avec ggvegan et ggplot2, facilitant une sortie graphique personnalisée (Figure 8).

Figure 8. Analyse de corrélation entre les facteurs environnementaux et la composition de la communauté microbienne (Liu et al. 2023).

Conclusion

Études métagénomiques réussir lorsque chaque étape du pipeline - filtrage de qualité, assemblage, binning, annotation et statistiques - fonctionne en harmonie. Par :

• Vérification de l'intégrité des données avant l'analyse,
• Éliminer la contamination hôte pour affiner les signaux microbiens,
• Choisir des outils d'assemblage adaptés à la taille du jeu de données et aux objectifs,
• Affinage des MAGs et des catalogues de gènes non redondants, et
• Lier la taxonomie, la fonction et l'environnement avec des statistiques rigoureuses,

les chercheurs obtiennent une vue panoramique de la diversité microbienne et de sa fonction. L'adoption de ces points de contrôle des meilleures pratiques améliorera la précision, réduira le temps de traitement et aidera à traduire les lectures de séquençage en informations écologiques ou cliniques. À mesure que les outils évoluent, l'évaluation régulière des nouveaux logiciels par rapport à votre flux de travail existant garantit que vos conseils de séquençage métagénomique restent à l'épreuve du temps et reproductibles.

Références :

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