Les SNPs sont une partie intégrante des études génétiques, et Génotypage SNP est une méthode courante de détection des SNP. Il existe de nombreuses méthodes de typage des SNP bien établies, chacune ayant ses propres caractéristiques et son applicabilité.
Les méthodes de saisie courantes incluent : Séquençage de Sangerréaction de détection de ligase (LDR) typage, multiplex Génotypage SNP SNaPshot, Génotypage SNP Taqman, Génotypage SNP MassArray et le typage PCR-RFLP, etc., offrant des solutions de typage SNP diversifiées pour les chercheurs.
Alors, comment choisir la bonne plateforme d'analyse pour votre expérience ? L'article décrit les caractéristiques techniques de chaque méthode de typage et les compare pour aider les chercheurs.
Le séquençage Sanger repose sur des réactions de terminaison par didéoxynucléotides pour générer des fragments de différentes longueurs pour le séquençage, et est le "standard d'or" pour la détection des SNP. Le taux de détection des SNP par séquençage Sanger est proche de 100 %.
L'avantage du séquençage de Sanger est que les résultats sont précis, non seulement pour déterminer le type et l'emplacement des mutations, mais aussi pour découvrir des loci SNP inconnus.
Cependant, son inconvénient est un faible débit et un coût élevé. Par conséquent, le séquençage de Sanger est adapté pour un typage à petite échelle avec peu de loci et peu d'échantillons. Cette technique de typage est très adaptée aux projets ayant des exigences de précision extrêmement élevées ou une taille d'échantillon extrêmement petite (quelques-uns ou des dizaines).
PCR-RFLP
La PCR-RFLP est la méthode de recherche la plus classique pour le typage des SNP. Son plus grand avantage est qu'elle ne nécessite pas d'instruments spéciaux, que l'opération du test est simple et peu coûteuse, et qu'elle est également adaptée à la détection d'échantillons de volume moyen ; l'inconvénient est que de nombreux loci SNP ne peuvent pas être détectés par cette méthode, et que certaines enzymes de restriction sont coûteuses et difficilement disponibles. Elle est sujette à des résultats faussement positifs et nécessite beaucoup de main-d'œuvre, prend un temps relativement long, et n'est pas adaptée à la détection de grands échantillons à haut débit. Il s'agit d'une technologie de typage SNP précoce, et il est difficile de répondre aux besoins de typage en série en termes de débit et d'efficacité, c'est pourquoi cette technologie n'est encore utilisée que dans des laboratoires individuels.
Un inconvénient majeur des puces SNP est qu'elles souffrent d'un biais de détermination, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent pas identifier les associations marqueur-caractéristique dans le cas des SNP qui n'étaient pas présents dans la population utilisée pour le développement de la puce. De plus, un inconvénient typique de l'utilisation des puces SNP est la possibilité que les informations (par exemple, la localisation chromosomique des SNP) utilisées pour la conception de la puce soient obsolètes et qu'il n'y ait pas de cohérence dans l'utilisation des SNP parmi les différents formats de puces de génotypage.
Génotypage SNP par PCR-RFLP et séquençage Sanger[1]
Avec la popularité de la technologie NGS, le débit de séquençage a considérablement augmenté et le coût de séquençage a été significativement réduit par rapport au séquençage Sanger. Le NGS peut être utilisé pour le typage SNP, non seulement la longueur de lecture du séquençage peut répondre aux exigences de typage, mais il peut également capturer des centaines de loci SNP en même temps, et les amorces à code-barres peuvent distinguer différents échantillons, permettant des expériences de typage à haut débit avec plusieurs loci et de grands échantillons en un seul séquençage.
Comparé au séquençage Sanger, cette méthode non seulement conserve les avantages du séquençage, mais compense également la limitation de son débit insuffisant et réduit considérablement la demande en volume d'échantillon. Le typage NGS est également en train d'être rapidement promu dans ce domaine.
Séquence RAD : découverte et génotypage des SNPs par séquençage de nouvelle génération pour le cartographie du génome[2]
Réaction de Détection par Ligase (LDR)
LDR utilise une ligase à haute température pour réaliser la reconnaissance des loci de polymorphisme génétique. Une fois que la ligase à haute température détecte un décalage de base dû à une mutation ponctuelle génétique à la jonction de l'ADN et de deux oligonucléotides complémentaires, la réaction de ligation ne peut pas se poursuivre.
Dans cette méthode, deux sondes de longueurs différentes sont conçues simultanément pour le locus SNP. Lorsque les extrémités des sondes ne sont pas appariées avec une base du modèle, la réaction de ligation ne peut pas être réalisée et il n'y a pas de produit de ligation ; au contraire, si la sonde est complètement complémentaire à l'ADN modèle, la réaction de ligation est alors réalisée, et cette réaction de ligation spécifique peut être répétée pour obtenir une amplification linéaire. Enfin, la détection du locus SNP est réalisée en scannant la longueur du fragment par fluorescence.
L'avantage de la méthode de détection de ligase LDR est qu'elle est applicable à tout locus polymorphe, que le résultat de typage est précis, que plusieurs réactions peuvent être effectuées, que le rapport coût-efficacité est élevé et que l'expérience est flexible. Cependant, comparé à la TaqMan et les méthodes de séquençage Sanger, la méthode LDR peut réaliser la détection simultanée de plusieurs loci et améliorer le débit de détection, il faut donc un certain temps pour établir un schéma de typage multiple dans la phase initiale. Cette méthode est très adaptée au même schéma de typage et aux exigences de typage d'échantillons continus, ce qui peut augmenter le débit expérimental et réduire le prix unitaire du typage.
Cette technologie, développée par Applied Biotechnology (ABI), est une technologie de typage basée sur le principe de l'extension de base unique marquée par fluorescence, et est principalement destinée aux projets de typage SNP à débit moyen. Le système de réaction contient des enzymes de séquençage, quatre ddNTPs marqués par fluorescence, des amorces et des modèles de produits PCR, et les amorces sont terminées après une extension de base. Après détection par le séquenceur ABI, le locus SNP correspondant au produit d'extension est déterminé en fonction du pic décalé, et le type de base incorporée peut être connu selon la couleur du pic, permettant ainsi de déterminer le génotype de l'échantillon. Les modèles de produits PCR peuvent être obtenus par le biais de plusieurs systèmes de réaction PCR.
Fonctionnalités de SNaPshot
(1) Saisie précise : obtenir directement les résultats de détection de la composition de base du locus, qui sont intuitifs et précis.
(2) Détection simultanée de plusieurs loci : La technologie de détection de plusieurs bases simples peut être utilisée pour détecter plusieurs loci SNP dans chaque réaction, tandis que le RFLP et le TaqMan ne peuvent en détecter qu'un à la fois.
(3) Pas limité par le type de polymorphisme du locus SNP : peu importe si le locus est hétérozygote ou s'il s'agit d'un polymorphisme d'insertion ou de délétion, il peut être détecté dans un seul système.
(4) Les échantillons contaminés peuvent être détectés : Si le spectre de pic de typage d'un échantillon s'écarte de la distribution normale, cela peut suggérer que l'échantillon est contaminé ou que la concentration est trop faible, tandis que d'autres méthodes de typage ne peuvent pas le faire. Il est généralement utilisé pour l'analyse de 10 à 30 loci SNP.
Le sondes TaqMan MGB ont une bonne capacité à identifier des séquences riches en A/T.
En raison du prix élevé des sondes MGB, la méthode de sonde Taqman est généralement utilisée pour l'analyse d'un grand nombre d'échantillons avec un petit nombre de loci SNP.
Génotypage SNaPshot SNP[3]
La spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice à temps de vol (MALDI-TOF MS) est l'outil d'analyse génétique leader mondial lancé par Sequenom.
Grâce à la sensibilité élevée de la spectrométrie de masse, il est facile de distinguer deux séquences génétiques contenant seulement une base différente et de dériver le typage SNP. La technologie iPLEX GOLD basée sur la plateforme MassARRAY permet de concevoir jusqu'à 40 réactions PCR multiplexées et la détection de génotypes, avec une conception expérimentale flexible et une grande précision des résultats de typage. Lors de tests de centaines à des milliers d'échantillons pour des dizaines à des centaines de loci SNP, MassARRAY offre le meilleur rapport qualité/prix et est particulièrement adaptée pour valider les résultats trouvés dans des études à l'échelle du génome ou lorsque un nombre limité de loci d'étude a été identifié.
Comparaison des méthodes de génotypage des SNP
| Méthode de génotypage |
Caractéristiques techniques |
Plage d'échantillonnage appropriée |
Débit de détection |
| Séquençage de Sanger |
1. Opération simple et précision maximale
2. Charge de travail lourde et coût élevé |
Adapté à la détection de typage avec de petits échantillons et un grand nombre de loci. |
1 000 fois par jour |
| Réaction de détection par ligase (LDR) |
1. Applicable à tout locus polymorphe
2. Saisie précise, avec une précision de plus de 95 %
3. Taux de détection élevé et temps de cycle court |
100-3000 échantillons, 1-20 locus |
10 000 fois par jour |
| Multiplex SNaPshot |
1. Saisie précise, avec une précision de plus de 95 %
2. Plusieurs loci peuvent être détectés simultanément.
3. Pas limité par le polymorphisme du locus SNP
4. Pas limité par le nombre d'échantillons |
100-4000 échantillons, 8-40 loci |
10 000 fois par jour |
| MassARRAY |
1. Haut débit : une puce peut réaliser des tests multiplexés sur 384 échantillons.
Jusqu'à 40 réactions par système
3. Rapport coût-efficacité élevé : pas de marquage fluorescent, seuls des amorces courantes doivent être synthétisées.
4. Haute sensibilité et flexibilité : précision >95 % ; taux de détection >90 % |
Adapté aux essais à haut débit avec 30 à 100 loci et plusieurs milliers d'échantillons. |
Haut débit |
| NGS |
1. Découverte de variants sans biais en utilisant uniquement des connaissances limitées sur la présence ou la nature des variants.
2. Capacités de haut débit et évolutivité
3. Taille d'échantillon réduite
4. Outils émergents conviviaux pour simplifier l'analyse des données |
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Découvrir et génotyper des milliers de SNP de manière efficace et précise. |
Basé sur l'excellente synthèse de amorces communes et d'amorces marquées par fluorescence, l'amplification PCR multiplex et les technologies de séquençage, CD Genomics a lancé Services de typage SNPIl couvre une plateforme complète de typage SNP allant du faible débit, au débit moyen jusqu'au haut débit, ce qui peut répondre aux besoins de projets de différentes échelles et vous fournir des services personnalisés et sur mesure.
Références :
- Rajkumar Sankaranarayanan et al.Association protectrice du haplotype A-T-T du gène DMT1 contre le risque de cataracte nucléaire liée à l'âge chez l'homme, mars 2019. Génétique ophtalmique 40(5):00-11
- Nazarul Hasan et al.Avancées récentes dans la sélection assistée par des marqueurs moléculaires et applications dans les programmes de sélection des plantes. Août 2021 Journal d'ingénierie génétique et de biotechnologie 19(128)
- Stéphanie Le Hellard et al.Génotypage SNP sur des ADN en pool : comparaison des technologies de génotypage et d'une méthode semi-automatisée pour le stockage et l'analyse des données Septembre 2002 Recherche sur les acides nucléiques 30(15):e74
- Maria Svidnicki et al.Dépistage des altérations génétiques liées à la perte auditive non syndromique utilisant la technologie MassARRAY iPLEX® septembre 2015 BMC Génétique Médicale 16(1)
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
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