Protocole de typage HLA par séquençage de nouvelle génération

Amplification de bibliothèque d'oligonucléotides personnalisée et ajout de promoteur T7

Amplification de bibliothèque d'oligonucléotides personnalisée (optionnelle)

1. Mélangez les composants suivants dans un tube stérile sans nucléase.

2. Effectuer une PCR.

3. Vortexez les billes AMPure XP pour les resuspendre.
Ajoutez 90 μL de billes resuspendues aux réactions de PCR. Mélangez en pipetant vers le haut et vers le bas au moins 15 fois.
5. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
6. Faites rapidement tourner le tube et placez-le sur un support magnétique pour séparer les billes du surnageant. Incubez à température ambiante jusqu'à ce que les billes soient complètement claires dans la solution. Retirez soigneusement et jetez le surnageant. Ne jetez pas les billes.
7. Ajoutez 200 μL d'éthanol à 70 % dans la plaque PCR tout en étant sur le support magnétique. Incubez à température ambiante pendant 1 minute, puis retirez et jetez soigneusement le surnageant.
8. Répétez la dernière étape une fois de plus.
9. Laissez sécher les perles à l'air pendant 5 minutes pendant que la plaque PCR est sur le support magnétique avec le couvercle ouvert. Enlevez tout liquide résiduel avec
une pipette.
10. Retirez le tube de l'aimant. Éluatez la cible d'ADN des billes dans 42 μL de tampon d'élution (EB) ou 0,1× TE. Pipetez de haut en bas au moins 15 fois. Faites rapidement tourner le tube et incubez à température ambiante pendant 2 à 3 minutes.
11. Placez l'échantillon sur un support magnétique approprié pour séparer les billes du surnageant. Après que la solution soit claire, transférez délicatement 40 μL de surnageant dans un nouveau tube PCR. Les échantillons peuvent être conservés à 2–8 °C pendant quelques jours ou à −20 °C pour un stockage à long terme.
12. Vérifiez la taille du produit.

Ajout du promoteur T7

1. Mélangez les composants du Tableau 3 dans un tube stérile sans nucléase.
2. Effectuer une PCR.
3. Pour nettoyer et effectuer une sélection de taille du produit PCR, vortexer les billes AMPure XP pour les resuspendre.
Ajoutez 50 μL de billes AMPure XP resuspendues (1×) à 50 μL de solution d'ADN. Mélangez bien en vortexant ou en pipetant vers le haut et vers le bas au moins 20 fois.
5. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
6. Placez le tube sur un support magnétique pour séparer les billes du surnageant. Une fois que la solution est claire, transférez délicatement le surnageant dans un nouveau tube et ne jetez pas le surnageant.
Ajoutez 30 μL de billes AMPure XP resuspendues (0,6×) au surnageant, mélangez bien et incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
8. Place le tube sur un support magnétique pour séparer les billes du surnageant. Une fois la solution claire, retirez soigneusement et jetez le surnageant. Faites attention à ne pas perturber les billes contenant les cibles d'ADN.

Ajoutez 200 μL d'éthanol à 80 % fraîchement préparé au tube tout en étant sur le support magnétique. Incubez à température ambiante pendant 30 s, puis retirez et jetez soigneusement le surnageant.
10. Répétez l'étape 9 une fois.
11. En maintenant le tube sur le support magnétique, laissez les billes sécher à l'air pendant 5 minutes.
12. Retirez le tube de l'aimant. Éluatez la cible d'ADN des billes dans 32 μL de tampon d'élution (EB) ou 0,1× TE. Mélangez bien sur
un mélangeur à vortex ou en pipetant de haut en bas, incubez pendant 2 minutes à température ambiante.
13. Place le tube dans un support magnétique jusqu'à ce que la solution soit claire, environ 3 minutes. Transférez environ 30 μL du surnageant dans un tube propre. Les échantillons peuvent être conservés à 2–8 °C pendant quelques jours ou à −20 °C pour un stockage à long terme.
14. Vérifiez la taille du produit.

Synthèse d'ARN à partir d'un modèle d'ADN (Transcription avec Biotine-UTP)

1. Décongelez les composants du kit, mélangez et faites tourner en microcentrifugeuse pour rassembler les solutions au fond des tubes. Gardez sur glace.
2. Assembler la réaction
3. Incuber la réaction à 37 °C pendant 14 h toute la nuit.
Ajoutez 70 μL d'eau sans nucléase, 10 μL de tampon de réaction 10× et 2 μL de DNase TURBO TM sans RNase à la réaction de 20 μL, mélangez et incubez à 37 °C pendant 15 minutes.
5. Purifiez les amorces d'ARN en utilisant le kit de purification RNeasy MinElute de Qiagen conformément au protocole du fabricant. Divisez le volume de la réaction et utilisez 50 μL par colonne. Éluez deux fois dans 15 μL et 10 μL d'eau stérile sans nucléase. Le volume total d'élution est de 25 μL.
Ajoutez 1 μL d'inhibiteur de RNase dans les appâts d'ARN elués.
7. Vérifiez la distribution des tailles et la concentration.
8. Ajustez la concentration des appâts à 100 ng/μL avec de l'eau très propre sans nucléase (utilisez un tube séparé d'eau sans nucléase uniquement à cette fin). La concentration de 100 ng/μL est considérée comme la solution mère des appâts d'ARN HLA.

Contrôle de qualité de la bibliothèque d'ARN Bait

Transcription inverse (synthèse d'ADNc)

1. Mélangez et centrifugez brièvement chaque composant du kit avant utilisation et combinez les composants dans un tube de 0,2 mL.

2. Incubez le tube à 65 °C pendant 5 minutes, puis placez-le sur de la glace pendant au moins 1 minute.
3. Préparez le mélange de synthèse de cDNA.

4. Ajoutez 10 μL de mélange de synthèse d'ADNc à la mixture d'appâts/amorces d'ARN, mélangez doucement et recueillez par une brève centrifugation.
5. Collectez la réaction par centrifugation brève. Ajoutez 1 μL de RNase H dans chaque tube et incubez les tubes pendant 20 minutes à 37 °C. La réaction de synthèse de cDNA peut être conservée à −20 °C pour un stockage à long terme ou utilisée immédiatement pour le qPCR.

qPCR SYBR Green

1. Mélangez les composants dans la plaque optique stérile à 96 puits pour la PCR en temps réel.

2. Exécutez les réactions.

3. Si la synthèse des amorces d'ARN a réussi, les valeurs CT devraient apparaître entre 10 et 15 cycles. Le témoin négatif ne devrait pas apparaître du tout ou à plus de 30 cycles.

Préparation de la bibliothèque

Fragmentation de l'ADN génomique

1. Pour réaliser la préparation de fin NEBNext, mélangez les composants dans un tube stérile exempt de nucléases.

2. Mélangez en pipetant, suivi d'une centrifugation rapide pour rassembler tout le liquide sur les parois du tube.
3. Placez dans un thermocycleur, avec le couvercle chauffé, et lancez le programme.

4. Mélangez en pipetant, puis effectuez une courte centrifugation pour rassembler tout le liquide sur les parois du tube.
5. Incuber à 20 °C pendant 15 minutes dans un thermocycleur.
Ajoutez 3 μL d'enzyme au mélange de ligation de l'étape précédente.
7. Bien mélanger et incuber à 37 °C pendant 15 minutes.
8. Nettoyage de l'ADN lié par un adaptateur.
Ajoutez 86,5 μL de billes AMPure XP resuspendues à la réaction de ligation. Mélangez bien en pipetant vers le haut et vers le bas au moins 10 fois.
10. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
11. Faites rapidement tourner le tube et placez-le sur un support magnétique approprié pour séparer les billes du surnageant. Une fois que la solution est claire (environ 5 minutes), retirez soigneusement et jetez le surnageant. Faites attention à ne pas perturber les billes contenant les cibles d'ADN.
12. Ajoutez 200 μL d'éthanol à 80 % fraîchement préparé dans le tube tout en étant sur le support magnétique. Incubez à température ambiante pendant 30 s, puis retirez et jetez soigneusement le surnageant.
13. Répétez l'étape 12 une fois.
14. Laissez sécher les billes à l'air pendant 5 minutes pendant que le tube est sur le support magnétique avec le couvercle ouvert.
15. Retirez le tube/plaque de l'aimant. Éluiez la cible d'ADN des billes en ajoutant 17 μL de Tris-HCl à 10 mM ou de TE à 0,1×.
16. Bien mélanger en pipetant de haut en bas, ou sur un mélangeur vortex. Incuber pendant 2 minutes à température ambiante.
17. Faites rapidement tourner le tube et placez-le sur le support magnétique.
18. Une fois que la solution est claire (environ 5 minutes), transférez 15 μL dans un nouveau tube PCR pour l'amplification.
19. Mélangez les composants dans des tubes à bande stériles pour commencer l'amplification PCR, y compris l'indexation. Exécutez le programme PCR.
Ajoutez 45 μL de billes AMPure XP resuspendues aux réactions PCR (~50 μL). Mélangez bien en pipetant vers le haut et vers le bas au moins 10 fois.
Incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
22. Faites rapidement tourner le tube et placez-le sur un support magnétique approprié pour séparer les billes du surnageant. Après que la solution soit claire (environ 5 minutes), retirez soigneusement et jetez le surnageant. Faites attention à ne pas perturber les billes contenant les cibles d'ADN.
Ajoutez 200 μL d'éthanol à 80 % dans la plaque PCR tout en étant sur le support magnétique. Incubez à température ambiante pendant 30 secondes, puis retirez et jetez soigneusement le surnageant.
Laissez sécher les perles à l'air pendant 5 minutes pendant que la plaque PCR est sur le support magnétique avec le couvercle ouvert.
25. Retirez le tube/plaque de l'aimant. Éluatez la cible d'ADN des billes dans 33 μL de TE 0,1×. Mélangez bien en pipetant vers le haut et vers le bas au moins 10 fois. Faites rapidement tourner le tube et incubez à température ambiante pendant 2 minutes.
26. Placez l'échantillon sur un support magnétique approprié pour séparer les billes du surnageant. Après que la solution soit claire (environ 5 minutes), transférez délicatement 28 μL de surnageant dans un nouveau tube PCR. Les bibliothèques peuvent être conservées à −20 °C.
27. Vérifiez la distribution des tailles avec un aliquote de la bibliothèque.

Enrichissement ciblé (basé sur des appâts)

Hybridation

1. Pour l'hybridation simpleplex (500 ng d'ADN en entrée), diluez la solution de stock des amorces d'ARN HLA (100 ng/μL) au rapport de 1:5 avec de l'eau sans nucléase.
2. Pour l'hybridation multiplex :
(a) 8 échantillons (62,5 ng d'ADN en entrée pour chacun), diluer la solution de stock des amorces HLA RNA 1:5 avec de l'eau sans nucléase.
(b) 6 échantillons (31,25 ng d'ADN en entrée chacun), diluer la solution de stock des amorces ARN HLA 1:5 avec de l'eau sans nucléase.
3. Configurez le programme sur un thermocycleur. Ce programme aidera lors du préchauffage des composants et effectuera finalement l'incubation à 65 °C pour l'hybridation.
4. Préparez le mélange de bibliothèque dans un tube sans nucléase et vortexez.
5. Préparez le mélange d'hybridation dans un tube sans nucléase et vortexez.
6. Préparez le mélange de capture dans un tube sans nucléase et vortexez.
7. Placez le mélange de bibliothèque dans un thermocycleur. Une fois que l'étape 2 du cycle est atteinte, placez le tube contenant le mélange d'hybridation dans le cycler pour effectuer le préchauffage. Lorsque l'étape 3 du cycler est atteinte, ajoutez le tube de mélange de capture au thermocycleur pour préchauffer également ce composant. L'étape 4 du cycler représente l'hybridation. Lorsque cette étape est atteinte, ajoutez 7 μL du mélange de bibliothèque préchauffé et 13 μL du mélange d'hybridation préchauffé au mélange de capture préchauffé. Mélangez par pipetage doux.
8. Incubez la réaction d'hybridation à 65 °C pendant 36 h.

Récupération de l'hybride ADN-appât

Transférez 50 μL de billes magnétiques dans un nouveau tube de 1,5 mL.
2. Peler les billes à l'aide d'un support à particules magnétiques et jeter le surnageant.
Ajoutez 200 μL de tampon de liaison aux billes pour les laver. Vortexez le tube pendant 5 à 10 secondes, placez-le sur un support pour particules magnétiques pendant 2 minutes pour faire précipiter les billes, puis retirez et jetez le surnageant.
4. Resuspendre les billes dans 200 μL de tampon de liaison.
6. Transférez la solution d'hybridation dans le Tampon de Liaison/ Billes et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Pélletez les billes avec un support magnétique pendant 2 minutes et éliminez le surnageant.
7. Ajoutez 500 μL de Tampon de Lavage 1 aux billes et vortexez brièvement pour les resuspendre. Incubez pendant 15 minutes à température ambiante. Pelletez les billes avec un support de particules magnétiques pendant 2 minutes et éliminez le surnageant.
8. Ajoutez 500 μL de Tampon de Lavage 2 à 65 °C aux billes et vortexez brièvement pour mélanger. Incubez pendant 10 minutes à 65 °C. Pélletez les billes avec un support magnétique pendant 2 minutes et éliminez le surnageant.
9. Répétez l'étape 8 deux fois pour un total de trois lavages à 65 °C. Assurez-vous que tout le tampon supplémentaire est éliminé.

Élution de l'ADN cible

Ajoutez 50 μL de tampon d'élution fraîchement préparé aux billes.
2. Vortexer pendant 5 à 10 s pour mélanger.
3. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
4. Pélletez les billes et transférez le surnageant dans un tube contenant 70 μL de tampon de neutralisation.

Purification par billes AMPure XP

Ajoutez 120 μL de billes AMPure XP et incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
2. Incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
3. Faites rapidement tourner le tube et placez-le sur un support magnétique approprié pour séparer les billes du surnageant. Une fois que la solution est claire, retirez soigneusement et jetez le surnageant. Faites attention à ne pas perturber les billes contenant les cibles d'ADN.
4. Ajoutez 200 μL d'éthanol à 80 % tout en maintenant le tube sur le support magnétique. Incubez à température ambiante pendant 30 s, puis retirez et jetez soigneusement le surnageant.
5. Séchez 5 minutes à température ambiante.
6. Retirez le tube de l'aimant. Ajoutez 30 μL de TE 0,1×. Mélangez bien en pipetant vers le haut et vers le bas au moins 10 fois. Faites rapidement tourner le tube et incubez à température ambiante pendant 2 minutes.
7. Placez l'échantillon sur un support magnétique approprié pour séparer les billes du surnageant. Une fois la solution claire, transférez délicatement 28 μL du surnageant dans un nouveau tube PCR.

Amplification de la cible enrichie

1. Préparez le mélange PCR sur de la glace dans un tube sans nucléase et mélangez en pipetant.
2. Placez les tubes dans un thermocycleur et lancez le programme.
3. Purifiez l'ADN avec des billes AMPure XP.
4. Valider et quantifier un aliquote de la bibliothèque enrichie.

Séquençage NGS d'une bibliothèque enrichie

1. Charge le HiSeq2500 avec la bibliothèque enrichie et effectue un séquençage en paire à l'aide du kit HiSeq® SBS v4 (250 cycles).
2. Fournissez les fichiers fastq démultiplexés issus de la course de séquençage pour l'analyse des données.

Référence :

1. Wittig M, Juzenas S, Vollstedt M, et al.Typage HLA haute résolution par séquençage de nouvelle génération de l'ADN cible fragmenté au hasard[M]//Typage HLA. Humana Press, New York, NY, 2018 : 63-88.