Détection à l'échelle du génome de la méthylation de la cytosine par séquençage en temps réel sur une seule molécule

Tse OYO, Jiang P, Cheng SH, Peng W, Shang H, Wong J, Chan SL, Poon LCY, Leung TY, Chan KCA, Chiu RWK, Lo YMD
PNAS 2 février 2021 118 (5) e2019768118

Résumé

La 5-méthylcytosine (5mC) est un type important de modification épigénétique. Le séquençage par bisulfite (BS-seq) présente des limitations, telles qu'une dégradation sévère de l'ADN. En utilisant le séquençage en temps réel à molécule unique, nous avons développé une méthodologie pour examiner directement la 5mC. Cette approche a examiné de manière holistique les signaux cinétiques d'une ADN polymérase (y compris la durée d'interpulse et la largeur d'impulsion) et le contexte de séquence pour chaque nucléotide dans une fenêtre de mesure, appelée modèle cinétique holistique (HK). La fenêtre de mesure de chaque molécule d'ADN double brin analysée comprenait 21 nucléotides avec une cytosine dans un site CpG au centre. Nous avons utilisé de l'ADN amplifié (non méthylé) et de l'ADN traité par M.SssI (méthylé) (M.SssI étant une méthyltransférase CpG) pour entraîner un réseau de neurones convolutionnel. L'aire sous la courbe pour différencier les états de méthylation en utilisant de tels échantillons était jusqu'à 0,97. La sensibilité et la spécificité pour la détection de la 5mC à l'échelle du génome avec une résolution à un seul nucléotide ont atteint respectivement 90 % et 94 %. Le modèle HK a ensuite été testé sur des fragments hybrides humain-souris dans lesquels chaque membre de l'hybride avait un statut de méthylation différent. Le modèle a également été testé sur des molécules d'ADN génomique humain extraites de divers échantillons biologiques, tels que le culot leucocytaire, les tissus placentaires et tumoraux. Les niveaux de méthylation globaux déduits par le modèle HK étaient bien corrélés avec ceux obtenus par BS-seq (r = 0,99 ; P < 0,0001) et ont permis la mesure de motifs de méthylation spécifiques aux allèles dans les gènes imprimés. Dans l'ensemble, cette méthodologie a fourni un système pour des analyses génétiques et épigénétiques simultanées à l'échelle du génome.

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