Fiche d'information sur le séquençage à représentation réduite : Méthodes, Avantages, Applications et Stratégies

Qu'est-ce que le séquençage à représentation réduite, RRS ?

Le séquençage à représentation réduite (RRS) est une approche visant à générer des données de séquençage à haut débit à l'échelle du génome et à obtenir un grand nombre de séquences de balises de polymorphisme génétique pour représenter pleinement les informations du génome de l'espèce. Le RRS simplifie non seulement la méthode de séquençage, puisque seuls les fragments digérés sont séquencés, mais il simplifie également le génome séquencé. Par conséquent, il est largement utilisé dans le développement de marqueurs moléculaires, l'analyse génétique des populations, la construction de cartes génétiques, le mapping de QTL, l'analyse d'association à l'échelle du génome et d'autres domaines de recherche sur les populations et de sélection moléculaire.

Introduction des méthodes utilisées pour le RRS

Il existe plusieurs méthodes différentes de RRS, y compris GBS, ddGBS, RAD, 2bRAD, ddRAD, SALF, etc. Les principes de ces méthodes sont essentiellement les mêmes, les différences résident dans l'utilisation d'enzymes de restriction simples ou doubles, les coupures aléatoires nécessaires, le code-barres requis, le kit spécial nécessaire, la conception de l'adaptateur et d'autres détails. L'introduction détaillée de ces méthodes est la suivante :

Figure 1. Processus expérimental de chaque méthode

Avantages du RRS

• Seules les fragments digérés sont séquencés, ce qui réduit considérablement la complexité du génome.
• Non limité par le génome de référence, également applicable aux espèces sans référence.
• Rentable, haute stabilité, particulièrement adapté à l'analyse d'un grand nombre d'échantillons.
• Large éventail d'applications : génétique des populations, cartographie génétique, cartographie des QTL, analyse d'association à l'échelle du génome, élevage moléculaire, etc.

Comparaison des différentes méthodes utilisées par RRS

Les différences de détails dans les méthodes utilisées par les RRS déterminent leurs différences d'application. Dans le tableau suivant, différentes méthodes de RRS sont comparées : (voir tableau 1)

Application des RRS

• Développement de marqueurs moléculaires: identification des marqueurs SNPs/InDel individuels, intégration des marqueurs SNPs de population ; calcul de la distance de liaison génétique des marqueurs polymorphes, construction de cartes génétiques à haute densité, et réalisation d'analyses d'association pour des traits particuliers, réalisation de cartographie fine des gènes en aval.
• Construction de cartes génétiques et cartographie des QTL: différenciation des groupes de liaison, classement des marqueurs massifs, dépistage des sites de ségrégation biaisée ; cartographie des QTL basée sur des données phénotypiques.
• Évolution génétique des populationsanalyse génétique des populations basée sur des données SNP, y compris l'analyse de l'évolution des populations, l'analyse de la structure des populations, le flux génétique, les tests de parenté, l'analyse en composantes principales (ACP), etc.
• Aider à l'assemblage de de novo carte génomique détailléeassemblage du génome brouillon, annotation des gènes, etc.
• Analyse d'association à l'échelle du génome (GWAS)Séquençage et analyse d'association à l'échelle du génome pour une certaine population d'espèces, et dépistage des sites régulateurs liés au génome pour des traits spécifiques.

Stratégie de sélection dans les méthodes RRS

• Objectif de l'étude :

  En fonction des différents objectifs expérimentaux, le nombre de marqueurs requis est complètement différent. Pour les études nécessaires à la recherche sur le balayage fonctionnel des intervalles et le minage fonctionnel des gènes dans l'ensemble du génome, telles que les GWAS et l'analyse de la pression de sélection, des dizaines de milliers de molécules à haute densité sont nécessaires. Cependant, la densité des marqueurs moléculaires pour les études sur les relations phylogénétiques, l'analyse de liaison, la structure des populations géographiques, le flux génétique et les tests de parenté n'a pas besoin d'être aussi élevée, généralement seulement quelques centaines à quelques milliers de marqueurs moléculaires suffisent. Pour les études de cartographie génétique, différents matériaux de recherche et populations de cartographie affecteront également le nombre de marqueurs nécessaires. Par exemple, le nombre de marqueurs requis pour l'analyse d'association à l'échelle du génome utilisant des populations naturelles est lié à la distance de déclin de l'LD de l'espèce, plus elle est rapide, plus il faut de marqueurs.

  Le nombre de marqueurs classés par : RAD≥GBS/SLAF>2b-RADAinsi, le nombre de marqueurs nécessaires pour l'étude peut d'abord être évalué, puis la technologie de séquençage génomique simplifiée appropriée peut être sélectionnée.

• Avec ou sans génome de référence :

  Si l'espèce étudiée n'a pas de génome de référence ou si la qualité de l'assemblage du génome de référence est médiocre, la technologie RAD peut être utilisée davantage, car la technologie RAD peut obtenir des fragments allant jusqu'à 400~500 bp grâce à un assemblage partiel, ce qui est favorable au développement de marqueurs moléculaires SSR et à la conception subséquente de primers ; GBS/SLAF peut également utiliser des méthodes de regroupement pour construire des séquences consensuelles afin de détecter des SNPs ; le 2b-RAD est sensible à l'interférence des séquences répétées en raison de ses fragments courts, et il n'est pas propice à la conception de primers pour vérifier les SNPs obtenus par séquençage. Par conséquent, le 2b-RAD nécessite généralement un génome de référence.

• Sélection des enzymes de restriction :

  Le choix de l'enzyme est déterminé par l'exigence de la densité des marqueurs. L'enzyme sélectionnée doit être adaptée à l'espèce étudiée (par exemple, prendre en compte le nombre d'enzymes dans les régions répétitives de l'espèce) ; certaines enzymes conviennent à certaines espèces, mais pas nécessairement à d'autres espèces ; les fragments de digestion enzymatique ont généralement des extrémités collantes, et différentes extrémités collantes peuvent nécessiter des conceptions d'adaptateurs différentes.

• Préparation d'échantillons d'ADN :

  Compte tenu de l'efficacité de digestion des enzymes, des échantillons d'ADN de haute qualité sont essentiels à l'ensemble du processus ; de plus, différentes méthodes nécessitent également un volume d'échantillon d'ADN.

Tableau 1. comparaison des différentes méthodes utilisées par RRS