Le flux de travail et les applications du séquençage d'amplicons

Introduction

La combinaison de l'enrichissement ciblé avec le séquençage de nouvelle génération (NGS), séquençage d'amplicons est une approche rapide et efficace qui permet aux chercheurs d'explorer les variations génétiques dans des régions génomiques spécifiques. Cette méthode utilise des sondes oligonucléotidiques spécifiques pour cibler et enrichir les régions d'intérêt, suivie d'un séquençage à haut débit. Cette approche hautement ciblée permet un séquençage ultra-profond des amplicons (produits de PCR), permettant une identification et une caractérisation précises et efficaces des mutations. Séquençage d'amplicons 16S/18S/ITS est largement utilisé pour les études de phylogénie et de taxonomie, en particulier dans métagénomique échantillons. De plus, des panneaux d'amplicons divers peuvent être établis pour le diagnostic et le pronostic des maladies.

Avantages

• Permet aux chercheurs de découvrir, valider et dépister des variants de manière ciblée et efficace.
• Prend en charge le multiplexage de milliers d'amplicons par réaction pour atteindre une couverture de séquençage élevée.
• Permet un séquençage ciblé même dans des zones complexes, telles que les régions riches en GC.
• Les conceptions de sondes flexibles soutiennent une large gamme d'expériences.
• Coûts de séquençage réduits et temps de réponse diminué

Flux de travail

Figure 1. Le flux de travail du séquençage d'amplicons.

1. Préparation des échantillons

Extraire l'ADN de l'échantillon et quantifier l'ADN.

2. Construction de la bibliothèque

L'approche PCR en deux étapes est couramment utilisée pour construire des bibliothèques de séquençage d'amplicons. Dans la première étape, des sondes oligonucleotidiques spécialement conçues sont utilisées pour amplifier des régions génomiques ciblées de l'ADN génomique préparé et attacher un code-barres (pour identifier les amplicons provenant de différents échantillons) aux amplicons. Dans la prochaine étape, des adaptateurs de séquençage sont attachés. Les bibliothèques doivent être validées et purifiées pour éliminer les amorces supplémentaires et les dimères d'amorces.

Figure 2. Le flux de travail de la PCR en deux étapes pour le séquençage des amplicons.

3. Séquençage

Les systèmes Illumina HiSeq/MiSeq et d'autres plateformes NGS peuvent être utilisés pour séquencer des amplicons. Le HiSeq peut générer un ordre de grandeur de lectures en plus que le MiSeq, mais prend plus de temps.

4. Analyse des données

La qualité des données séquencées doit être évaluée. Cette étape détermine quelles lectures doivent être conservées, filtrées, ajustées ou supprimées. Des données propres de haute qualité sont utilisées pour l'analyse postérieure.

Tableau 1. Analyse des données de séquençage d'amplicons.

Applications

Le séquençage par amplicon offre la flexibilité pour des projets ciblant les études de génétique des populations, le cancer et les maladies génétiques, qu'ils soient définis par des experts ou désignés par des clients. Il permet également la découverte de variants somatiques et germinaux.

Le séquençage d'amplicons a été appliqué aux domaines suivants :

Champ médicaldécouvrez comment les microbes humains, la santé humaine/les maladies et les gènes associés aux maladies sont liés ; diagnostic clinique et pronostic ; pharmacogénomique ; etc..

Champ agricole: explorer l'interaction entre les microorganismes et les plantes ou le bétail ; génie génétique ; sélection assistée par marqueurs ; etc..

domaine environnemental: surveillance et évaluation environnementales ; amélioration de l'environnement ; etc..

Référence :

1. Bybee S M, Bracken-Grissom H, Haynes B D, et al. Séquençage d'amplicons ciblés (TAS) : une approche évolutive de nouvelle génération pour la phylogénétique multilocus et multitaxa. Biologie du génome et évolution, 2011, 3 : 1312-1323.