Qu'est-ce que le séquençage CUT&RUN et comment se compare-t-il au CUT&Tag ?

Actuellement, la recherche épigénétique fait face à de nouveaux défis tels que la résolution à cellule unique, le suivi des processus dynamiques et la compatibilité avec les échantillons cliniques. Par exemple, la distribution dynamique des marqueurs d'hétérochromatine pendant le développement embryonnaire repose sur les caractéristiques de haute résolution de CUT&RUN, tandis que les faibles quantités dans les échantillons de biopsie clinique sont mieux adaptées à l'avantage du faible montant de départ de CUT&Tag. Cet article vise à passer en revue de manière systématique les principes techniques, les différences fondamentales et les scénarios applicables de CUT&RUN et CUT&Tag, fournissant aux chercheurs une référence pour sélectionner les méthodes appropriées en fonction du type de protéine cible, de l'état de la chromatine et des besoins expérimentaux, et promouvant la recherche épigénétique vers une plus grande précision et une applicabilité plus large.

Comparaison des principes et des technologies

Séquençage CUT&RUN : Principes et caractéristiques

CUT&RUN (Clivage sous Cibles et Libération par Nuclease) est une technique d'analyse de la chromatine ciblée par anticorps. Elle utilise la micrococcale nuclease (MNase) pour cliver l'ADN près du site de liaison de la protéine cible et libérer directement le fragment pour le séquençage.

• Ses étapes clés comprennent :
  • Fixation et perméabilisation des cellules : Les cellules vivantes sont fixées à l'aide de billes magnétiques de concanavaline A (ConA), et la perméabilisation de la membrane cellulaire est réalisée à l'aide de digitonine, éliminant ainsi le besoin de réticulation au formaldéhyde.
  • Incubation d'anticorps : Des anticorps spécifiques ciblent et se lient à la protéine cible (comme les modificateurs d'histones ou les facteurs de transcription) et sont recrutés sur le site de liaison à la chromatine par l'enzyme pA-MNase, une enzyme de fusion protéine A/G.
  • Clivage par MNase : Après activation par le Ca²⁺, la MNase clive l'ADN flanquant la protéine cible, libérant un fragment d'environ 300-500 pb qui diffuse vers la région extranucleaire.
  • Purification de l'ADN et construction de bibliothèque : L'ADN est directement purifié, réparé aux extrémités, doté d'une queue A et ligaturé avec des adaptateurs de séquençage sans avoir besoin de l'étape de disruption par sonication dans les méthodes traditionnelles. ChIP.
• Avantages :
  • Haute résolution : La localisation des sites de liaison est précise à ±50 pb, ce qui la rend particulièrement adaptée à la recherche sur les facteurs de transcription pionniers (comme CTCF).
  • Adéquation de l'hétérochromatine : Les enzymes MNase ont un faible poids moléculaire et peuvent cliver efficacement les régions d'hétérochromatine étroitement compactées (comme les sites de modification H3K9me3), ce qui les rend adaptées à des scénarios complexes tels que le développement embryonnaire.
  • Bruit de fond faible : Élimine le besoin de disruption par sonication, réduisant les interférences dues aux ruptures aléatoires de l'ADN.

Performance globale de "CUT&RUN sur plaque" (Miura M et al., 2020)

CUT&Tag : Innovation technologique et processus simplifié

CUT&Tag (Clivage sous Cibles et Tagmentation) est une amélioration de CUT&RUN, utilisant la protéine de fusion pA-Tn5 transposase pour réaliser simultanément la coupure de l'ADN et l'ajout d'adaptateurs de séquençage, simplifiant ainsi considérablement les procédures expérimentales.

• Son flux de travail comprend :
  • Incubation des anticorps : Les cellules sont immobilisées à l'aide de billes magnétiques de concanavaline A, et les anticorps ciblent et se lient à la protéine cible.
  • Transposition Tn5 : Après activation de la transposase, l'ADN est directement clivé au site cible et des adaptateurs de séquençage sont insérés.
  • Amplification de bibliothèque : Aucune réparation de fin n'est requise ; les bibliothèques de séquençage sont générées directement par amplification PCR.
• Avantages :
  • Opération facile : Élimine les étapes de réticulation et de sonication, réduisant le cycle expérimental à 1 jour.
  • Faible volume de départ : seulement 500 à 50 000 cellules sont nécessaires, et même l'analyse de cellules uniques est prise en charge.
  • Rapport signal/bruit élevé : La clivage ciblé réduit le bruit de fond non spécifique, ce qui entraîne un taux de validité des données dépassant 80 %.

Différences techniques entre CUT&RUN et CUT&Tag

Analyse des différences clés

• Pénétration de la membrane nucléaire et état de la chromatine :
  • CUT&RUN fixe les cellules vivantes en utilisant des billes magnétiques ConA, et la MNase ne clive que les sites de liaison des protéines cibles, offrant une forte pénétration dans l'hétérochromatine (par exemple, H3K9me3).
  • CUT&Tag s'appuie sur la transposase Tn5, qui préfère la chromatine ouverte et peut avoir une couverture insuffisante de l'hétérochromatine, ce qui peut entraîner des faux négatifs.
• Contrôle du bruit de fond :
  • CUT&RUN utilise une coupure précise par MNase, libérant uniquement l'ADN du site cible et entraînant des signaux de fond très faibles.
  • La transposase Tn5 de CUT&Tag peut cliver des régions non ciblées, nécessitant une optimisation des anticorps et des conditions de réaction pour réduire le bruit.

Différences clés : Scénarios d'application et limitations

(1) Détection des modifications d'histones de l'hétérochromatine

• CUT&RUN est supérieur : la MNase peut cliver les régions d'hétérochromatine, tandis que l'enzyme Tn5 dans CUT&Tag a du mal à cliver efficacement la chromatine fermée en raison de l'encombrement stérique. Par exemple, des recherches menées par Ruimin Xu et al. montrent que la distribution dynamique de H3K9me3 dans le développement embryonnaire humain dépend de CUT&RUN.

• Limitations de CUT&Tag : l'enzyme Tn5 préfère la chromatine ouverte, ce qui entraîne une couverture insuffisante de l'hétérochromatine, ce qui peut conduire à des résultats faussement négatifs.

Schéma de préparation d'échantillons et de CUT&RUN des modifications des histones dans les embryons humains pré-implantation (Xu R et al., 2022)

(2) Résolution des sites de liaison des facteurs de transcription

• CUT&RUN a une résolution plus élevée : la coupure par MNase produit des fragments d'ADN plus courts avec des limites de sites de liaison plus claires, ce qui le rend particulièrement adapté à l'étude des facteurs de transcription pionniers. Par exemple, l'efficacité d'enrichissement du CUT&RUN-qPCR est 10 fois supérieure à celle du ChIP-qPCR traditionnel.

• Applicabilité de CUT&Tag : Cela fonctionne bien pour la plupart des facteurs de transcription (comme l'ARN polymérase II), mais la résolution est relativement faible (environ 200-500 pb).

(3) Complexité expérimentale et coût

• CUT&Tag est plus simple : aucune préparation de bibliothèque ni étapes de réparation ne sont nécessaires, ce qui le rend adapté au traitement d'échantillons à haut débit.

• CUT&RUN est légèrement plus coûteux : une optimisation supplémentaire de l'activité de la MNase et de la ligation des adaptateurs est nécessaire, mais la qualité des données est plus stable.

Recommandations

Scénarios où CUT&RUN est préféré

Une localisation haute résolution des sites de liaison des facteurs de transcription est requise.

Par exemple, Miura M et al. ont utilisé la technologie CUT&RUN pour analyser les caractéristiques de liaison de la chromatine de l'ARN polymérase II (Pol II) dans la lignée cellulaire de cancer du poumon humain A549, révélant la signification biologique unique de deux structures de liaison différentielles de Pol II près du site de début de transcription (TSS) et de courtes empreintes d'ADN. Les principales conclusions sont les suivantes : en utilisant CUT&RUN (ciblant les empreintes de protéines de reconnaissance de clivage de l'ADN par la nucléase micrococcale) comme outil, la distribution de Pol II dans les cellules A549 a été analysée :

• Long fragments (>270 pb) : Correspondant à une distribution bimodale autour du TSS (similaire aux résultats classiques de ChIP), représentant un Pol II en pause (liée à des complexes tels que NELF, et étant arrêté après l'initiation de la transcription) ;

• Fragments courts (< 120 pb) : Représentant environ 5 % des lectures totales, mais un pic clair peut être identifié au niveau du TSS — il s'agit d'une localisation transitoire de Pol II avant la pause près du promoteur (non détectée par ChIP conventionnel). Certains fragments courts peuvent également correspondre à une "initiation abrupte" (Pol II est libéré du site de départ mais ne peut pas prolonger la transcription).

• Signification

• Les empreintes uniques de courts fragments (< 120 pb) révèlent la localisation transitoire de Pol II près du promoteur, complétant les zones d'ombre de la ChIP classique ;

• L'emplacement des grandes empreintes (longs fragments) est corrélé à la directionnalité transcriptionnelle, clarifiant la valeur fonctionnelle des différentes empreintes CUT&RUN.

Hypothèse de travail sur les empreintes de Pol II et le ralentissement de Pol II (Miura M et al., 2020)

Analyse des marqueurs de l'hétérochromatine

Par exemple, Yang H et al. ont utilisé CUT&RUN pour localiser les modifications des histones à travers tout le génome et ont découvert que la déficience en Brd4 entraînait une augmentation globale des niveaux d'enrichissement de deux marqueurs de chromatine active (H3K122ac : lié à la transcription active ; H3K4me3 : marqueur de promoteur actif) dans les HSC/HPC. Ce changement coïncidait avec la régulation à la hausse de l'expression des gènes liés au vieillissement. Ce résultat révèle le mécanisme par lequel Brd4 maintient la fonction des HSC/HPC et prévient le vieillissement en régulant les modifications des histones (en inhibant la sur-enrichissement de H3K122ac/H3K4me3).

Scénarios prioritaires pour CUT&Tag

Taille d'échantillon limitée ou nécessitant des cycles expérimentaux rapides

Par exemple, Wu SJ et al. ont utilisé la technologie scCUT&Tag pour réaliser une analyse du paysage chromatinien à l'échelle unicellulaire de modifications spécifiques des histones (H3K27me3).

• Différenciation des types cellulaires et génération du paysage PcG : l'analyse scCUT&Tag de H3K27me3 peut différencier les types cellulaires sanguins humains, générant des paysages PcG spécifiques aux types cellulaires à partir de tissus hétérogènes.

• Analyse de l'hétérogénéité tumorale :
  • L'analyse de H3K27me3 chez des patients atteints de tumeurs cérébrales avant et après traitement (y compris les échantillons de rechute) a identifié des types cellulaires et une hétérogénéité de l'activité des PcG dans le microenvironnement tumoral ;
  • Quatre types de cellules ont été identifiés dans des échantillons en rechute, révélant un enrichissement du cluster T1 (similaire au cluster T1 dans les tumeurs primaires). Dans les clusters de cellules résistantes aux médicaments, le génome preneuronal (Verhaak_glioblastoma_proneural) a été silencé, et le paysage de PcG a approché un état semblable à celui des cellules souches (non terminalement différenciées).

Études sur les modifications des histones dans les régions de chromatine ouverte

Par exemple, Xie B et al. ont utilisé la technologie CUT&Tag pour détecter le rôle régulateur de la lactylation de l'histone H3K18 (H3K18la) dans le cancer de la vessie, découvrant que :

• H3K18la est enrichi dans les régions promoteurs de nombreux gènes ;

• Le séquençage CUT&Tag a révélé que les gènes liés à H3K18la sont riches en plusieurs voies de signalisation régulant la tumorigenèse, indiquant que H3K18la joue un rôle crucial dans la progression du cancer de la vessie humain.

• La région du promoteur LCN2 est enrichie en H3K18la ;

• Les inhibiteurs de la glycolyse ou la surexpression de circXRN2 peuvent réduire l'interaction entre H3K18la et le promoteur de LCN2, vérifiant le rôle régulateur clé de H3K18la dans la transcription de LCN2 (confirmé par la suite). Expériences ChIP).

Résumé

Les méthodes CUT&RUN et CUT&Tag ont révolutionné les paradigmes de recherche sur la chromatine, mais chacune a son propre accent :

• CUT&RUN : Excelle en haute résolution et en compatibilité avec l'hétérochromatine, en faisant la "référence" pour les études épigénétiques complexes.

• CUT&Tag : Les avantages incluent la facilité d'utilisation et de faibles quantités de départ, ce qui en fait l'outil préféré pour l'analyse des modifications des histones de routine.

Les deux sont complémentaires plutôt qu'interchangeables ; les chercheurs devraient choisir de manière flexible en fonction du type de protéine cible, des caractéristiques de l'échantillon et des exigences expérimentales.

Les gens demandent aussi

Quelle est la différence entre CUT&RUN et CUT&Tag ?

CUT&RUN utilise la pAG-MNase activée par Ca2+ pour cliver l'ADN tandis que CUT&Tag utilise la pAG-Tn5 activée par Mg2+ pour cliver l'ADN.

Qu'est-ce que le séquençage CUT&RUN ?

CUT&RUN est une technique de profilage de la chromatine ciblée par des anticorps qui clive l'ADN in situ au sein de noyaux perméabilisés, permettant un cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN avec un faible bruit de fond et un minimum d'entrée cellulaire.

Quels sont les avantages de CUT&RUN par rapport à ChIP-seq ?

CUT&RUN offre des avantages clés par rapport au ChIP-seq, notamment un bruit de fond plus faible, une résolution supérieure, un protocole plus rapide et des exigences en matière d'entrée cellulaire considérablement réduites.

Quelle est la différence entre CUT&Tag et séquençage ATAC?

ATAC-Seq permet aux chercheurs de détecter les emplacements de la chromatine ouverte, des nucléosomes et des facteurs de transcription occupés en utilisant un Tn5 chargé d'adaptateurs. CUT&Tag révèle les interactions protéine-chromatine en utilisant un anticorps cible et un pA-Tn5 chargé d'adaptateurs.

Références

1. Miura M, Chen H. CUT&RUN détecte des empreintes ADN distinctes de l'ARN polymérase II près des sites de début de transcription.. Recherche sur les chromosomes. Déc 2020 ; 28(3-4) : 381-393.
2. Xu R, Li S, Wu Q, Li C, Jiang M, Guo L, Chen M, Yang L, Dong X, Wang H, Wang C, Liu X, Ou X, Gao S. L'occupation spécifique de H3K9me3 assure le silence des rétrotransposons dans les embryons humains pré-implantation.. Cellules souches de la cellule. 2022 7 juil.;29(7):1051-1066.e8.
3. Yang H, Sui P, Guo Y, Chen S, Maloof ME, Ge G, Nihozeko F, Delma CR, Zhu G, Zhang P, Ye Z, Medina EA, Ayad NG, Mesa R, Nimer SD, Chiang CM, Xu M, Chen Y, Yang FC. La perte de BRD4 induit la sénescence cellulaire dans les HSC/HPC en dérégulant le découpage de l'histone H3.. EMBO Rep. 2023 9 oct;24(10):e57032.
4. Wu SJ, Furlan SN, Mihalas AB, Kaya-Okur HS, Feroze AH, Emerson SN, Zheng Y, Carson K, Cimino PJ, Keene CD, Sarthy JF, Gottardo R, Ahmad K, Henikoff S, Patel AP. Analyse CUT&Tag à cellule unique des modifications de la chromatine dans la différenciation et la progression tumorale. Nat Biotechnol. Juil 2021;39(7):819-824.
5. Xie B, Lin J, Chen X, Zhou X, Zhang Y, Fan M, Xiang J, He N, Hu Z, Wang F. CircXRN2 supprime la progression tumorale induite par la lactylation des histones en activant la voie Hippo dans le cancer de la vessie humain.. Mol Cancer. 2023 Sep 8;22(1):151.