Recherche sur les maladies rares avec séquençage de l'exome complet

les maladies rares sont celles dont les taux d'incidence sont extrêmement bas. Il existe environ 7 000 maladies rares dans le monde, dont beaucoup sont d'origine génétique. La recherche sur ces maladies fait face à des défis importants en raison de leurs symptômes divers, de leurs mécanismes pathogéniques complexes et du manque de traitements efficaces. Ces dernières années, séquençage de l'exome entier Le séquençage de l'exome entier (WES), une technologie de séquençage génomique à haut débit, est devenu un outil important pour la recherche sur les maladies rares. Cet article explorera les applications et les avantages du séquençage de l'exome entier dans la recherche sur les maladies rares.

I. Contexte technique et avantages clés

WES identifie rapidement les mutations pathogènes en ciblant environ 1 % des régions exoniques (fragments d'ADN codant des protéines) du génome à l'aide de la technologie de séquençage à haut débit. Comparé à séquençage du génome complet (WGS), le WES est moins coûteux (environ 1/10 du coût du WGS), offre une analyse des données plus efficace et couvre plus de 85 % des mutations pathogènes connues. Ses principaux avantages sont :

• Localisation hautement efficace des gènes pathogènes : En comparant les variations d'exons entre les patients et les individus en bonne santé, combiné à un filtrage bioinformatique (tel que l'exclusion des variations communes et le dépistage des mutations fonctionnellement dommageables), les gènes associés aux maladies rares peuvent être rapidement identifiés. Par exemple, le gène pathogène DHODH pour le syndrome de Miller a été découvert chez quatre patients en utilisant le séquençage de l'exome (WES).
• Adapté aux études sur de petits échantillons : L'analyse de liaison traditionnelle nécessite un grand nombre d'échantillons familiaux, tandis que le séquençage de l'exome entier (WES) ne nécessite que quelques patients pour découvrir de nouveaux gènes pathogènes, abaissant ainsi considérablement le seuil de recherche.
• Support pour l'analyse multidimensionnelle : La combinaison des données de transcriptome et d'épigénomique peut révéler des mécanismes régulateurs complexes (comme l'impact des variations des régions non codantes sur l'épissage).

II. Cas d'application clinique

Cas 1 : Analyse WES de 58 enfants gravement malades

1. Technologie de base : Détection combinée des CNVs et des SNVs

WES détecte non seulement les SNV mais identifie également les CNV en utilisant des outils bioinformatiques, permettant une capture complète des variants pathogènes dans les maladies rares :

• Détection des CNV : Le séquençage de l'exome entier (WES) a identifié deux CNV pathogènes nouveaux (déletion 7q36.3 + duplication 18q12.1q23 chez le patient P9 et déletion 20q13.13 chez le patient P10). La validation par CMA a confirmé l'implication de gènes de haploinsuffisance ClinGen (tels que SHH et ADNP), expliquant des phénotypes tels que la micrognathie, le retard de développement et l'hypertélorisme, aucun de ces phénotypes n'ayant été précédemment rapporté.
• Détection des SNV : Des SNV pathogènes/probablement pathogènes (P/LP) ont été trouvés chez 25 des 58 patients (43,1 %), impliquant 24 gènes (y compris 23 SNV nouveaux), comprenant des hétérozygotes composés (11 cas), des homozygotes (2 cas) et des variants récessifs liés à l'X (1 cas). Par exemple :
  • Des variants hétérozygotes complexes du gène ACAT1 (P14/P15) provoquent une acidose métabolique sévère ;
  • Les variants hétérozygotes du complexe du gène COG4 (P21) provoquent un trouble de la glycosylation congénital (type IIj) ;
  • Les variants pathogènes du gène TOR1A (P8) sont associés aux tumeurs cérébrales et à l'insuffisance respiratoire.

2. Résultats Diagnostiques : Améliorer le Taux de Diagnostic et l'Expansion Phénotypique des Maladies Rares

• Taux de diagnostic global : Sur 58 patients, 27 (56,9 %) avaient des résultats génétiques, et 25 (43,1 %) ont reçu un diagnostic génétique définitif, avec un taux de diagnostic cumulé significativement plus élevé que les méthodes traditionnelles.
• Pouvoir explicatif phénotypique : Dans 72,7 % des patients avec des résultats génétiques (24/33), le génotype pouvait expliquer le phénotype principal (par exemple, la variante COG4 dans P21 explique la jaunisse et l'épilepsie ; la variante ACAT1 dans P15 explique l'acidose métabolique), tandis que seulement 6 cas (18,2 %) avaient des phénotypes partiellement expliqués par le génotype (principalement superposés à des infections sévères).
• Distribution des maladies : Implique des maladies rares touchant plusieurs systèmes, y compris des troubles métaboliques (ACAT1, PNPO), des troubles neurodéveloppementaux (COG4, WDR73), des immunodéficiences (SH3KBP1) et des anomalies squelettiques (IQCE). Des infections sévères (pneumonie, sepsis, infection cérébrale) sont des symptômes accompagnants fréquents (70,4 % des patients atteints de maladies génétiques présentent des infections concomitantes, avec un taux de mortalité de 68,4 %).

3. Valeur fondamentale : Analyse complexe des génotypes et découverte de nouveaux gènes

• Identification complexe de génotypes : Le WES corrige les erreurs de jugement dans l'analyse traditionnelle des SNV. Par exemple, le patient P8, basé sur une grande délétion du chromosome X (s'étendant presque sur le bras p/q) et l'analyse des SNV, était présumé avoir le syndrome de Turner (45,X), et une variante pathogène de TOR1A a été découverte. Onze patients porteurs du gène AR ont été identifiés comme pseudohomozygotes grâce à l'analyse de l'hétérozygotie complexe CNV+SNV (par exemple, le SNV du gène PNPO + duplication causant l'épilepsie).
• Variantes novatrices et expansion phénotypique : 23 nouveaux SNV (15 gènes) et 2 nouveaux CNV ont été découverts, élargissant les associations gène-phénotype pour 19 maladies rares. Par exemple :
  • La duplication du gène SH3KBP1 (P9) suggère une association entre l'immunodéficience liée à l'X-61 et les anomalies neurodéveloppementales ;
  • La délétion du chromosome 4 (P11) soutient le rôle de la région 4p14-p13 dans le neurodéveloppement (Liu J et al., 2021).

Diagramme de flux de la sélection des patients et des résultats génétiques dans l'étude (Liu J et al., 2021)

Cas 2 : Application de l'EWS dans l'hypophosphatasie

(1) Diagnostic et Classification de l'HPP

Détection directe des variations du gène ALPL : Chez trois patients (Cas 1, 2 et 3), le séquençage de l'exome entier (WES) a confirmé des variations hétérozygotes du gène ALPL (par exemple, c.1447G>A/p.Val483Met, c.205G>A) découvertes par Séquençage de SangerAssocié à des phénotypes tels qu'une faible activité de TNSALP (TSALP) et des malformations squelettiques, l'HPP (infantile ou légère) a été diagnostiquée.

(2) Identification des maladies génétiques complexes

• Découverte de variations co-segregantes : Dans le cas 1, le séquençage de l'exome entier (WES) a découvert une variation hétérozygote du gène SMC1A (c.3470del) basée sur les variations ALPL, expliquant les phénotypes chevauchants du patient tels que l'épilepsie et le retard de développement (HPP et épilepsie développementale 85 co-segregés) ; dans le cas 2, le WES a découvert une variation homozygote du gène WNT10A (c.682T>A), suggérant une association potentielle entre les anomalies de développement ectodermiques et le phénotype HPP.
• Correction d'un diagnostic erroné d'un gène unique : Dans le cas 6, le patient était initialement suspecté d'avoir une HPP (TSALP bas). Le séquençage de l'exome entier (WES) n'a pas trouvé de variantes ALPL, mais a détecté une variante homozygote du gène SLC5A1 (c.1946G>A), confirmant une malabsorption du glucose et du galactose (GGM). Les symptômes se sont améliorés grâce à une intervention diététique (suppression du lactose/glucose/saccharose), évitant ainsi un traitement inefficace pour la HPP.

(3) Diagnostic différentiel en l'absence de variants ALPL

• En se tournant vers d'autres gènes pathogènes : Dans le Cas 4 (aucune variante ALPL détectée), le séquençage de l'exome entier a trouvé des variantes hétérozygotes (VUS) des gènes TRIO (c.5651A>C) et TRPV4 (c.880T>G), suggérant un lien potentiel entre le neurodéveloppement et le métabolisme osseux anormal ; dans le Cas 5, des variantes du gène TTN (c.32078-1G>T, c.47720_47721del) ont été détectées, pointant vers la myopathie de Salih (myopathie congénitale de type 5).
• Valeur clinique des résultats négatifs : Dans le cas 7, le séquençage de l'exome entier (WES) n'a pas détecté de variations des gènes ALPL et autres. Associée à une analyse phénotypique approfondie (caractéristiques faciales, antécédents intra-utérins), le diagnostic du syndrome d'alcoolisation fœtale a été confirmé, clarifiant la cause non héréditaire et évitant des tests excessifs (Glotov OS et al., 2024).

Dynamique dépendante du temps des fluctuations des résidus d'acides aminés pour les protéines WNT10A de type sauvage et mutées Phe228Ile (Glotov OS et al., 2024)

Applications du séquençage de l'exome entier (WES) dans les maladies rénales héréditaires extrêmement rares

1. Surmonter les limitations de l'analyse des panels génétiques pour détecter des maladies extrêmement rares

Les panels géniques ciblés ne couvrent que 20 à 100 gènes de maladies rénales héréditaires connus, tandis que le séquençage de l'exome entier (WES) couvre l'intégralité de l'exon, permettant la détection de maladies extrêmement rares non incluses dans les panels (telles que le syndrome rénal dans les familles 5-7 et 9, l'hypercalcémie infantile de type 1, etc.), évitant ainsi des délais de diagnostic prolongés et des coûts dus aux omissions des panels.

2. Identification des variants pathogènes inattendus et validation de l'association "génotype-phénotype"

WES a diagnostiqué des maladies inattendues (comme le syndrome d'Ayme-Gripp causé par la mutation MAF dans la famille 3, et la dysplasie thoracique à côtes courtes de type 9 causée par la mutation IFT140 dans la famille 4). Grâce au paradigme génotype-phénotype de "informations cliniques + séquençage du génome", il vérifie la pleine responsabilité de la variante pour le phénotype (par exemple, la mutation MAF explique les déformations faciales, la perte d'audition et l'implication rénale ; la mutation IFT140 explique la dysplasie squelettique et l'insuffisance rénale terminale précoce).

3. Intervention de précision guidée et prédiction pronostique

• Interprétation pathophysiologique : Par exemple, dans la famille 2, la déficience en APRT (variante homozygote sans sens) indique clairement une production excessive de 2,8-dihydroxyadénine entraînant des calculs rénaux, nécessitant des inhibiteurs de la xanthine oxydase et un régime alimentaire restrictif en urée ;
• Ajustement du traitement : Dans la famille 8, la mutation hétérozygote complexe TRPM6 entraîne une hypomagnésémie, nécessitant un ajustement de la supplémentation en calcium et en magnésium (arrêt du calcium et augmentation du magnésium) ;
• Décision de transplantation : Dans la famille 1, ADTKD-UMOD (variante de changement d'acide aminé UMOD), la transplantation rénale d'un enfant non affecté est choisie ;
• Surveillance pronostique : Dans la famille 4, la SRTD 9 (variante IFT140) nécessite une surveillance régulière de la fonction hépatique, de la progression osseuse et du décollement de la rétine.

Sur la base du séquençage de l'exome complet et de la pathogénicité, les généalogies de neuf familles ont été présentées (Jung J et al., 2021).

III. Défis techniques et solutions

Complexité de l'analyse des données

• Défi : Les données WES nécessitent le traitement de millions de variants, ce qui rend difficile la distinction entre les variants pathogènes et bénins.
• Solution :
  • Assistance en apprentissage automatique : Des outils tels que FABRIC GEM, en intégrant des données multi-omiques, améliorent l'efficacité du dépistage des gènes candidats à une moyenne de 2 gènes/cas.
  • Validation fonctionnelle : Combinaison de modèles animaux (par exemple, édition CRISPR) et d'expériences sur organoïdes pour valider l'impact des mutations sur la fonction des protéines.

Goulots d'étranglement dans la traduction clinique

• Défi : La pathogénicité de certaines variantes reste encore floue, et l'hétérogénéité phénotypique doit être prise en compte.
• Solution :
  • Annotation standardisée : En se référant aux directives de l'ACMG, combiner les bases de données de population (par exemple, gnomAD) et les outils de prédiction fonctionnelle (par exemple, PolyPhen-2) pour une évaluation hiérarchique.
  • Collaboration multi-centres : Établissement de bases de données sur les maladies rares (par exemple, le "Projet Huabiao") pour partager la fréquence des variants et les données phénotypiques cliniques.

Questions éthiques et de confidentialité

• Défi : Comment fournir des retours aux patients sur les résultats secondaires (par exemple, le statut de porteur chez les adultes).
• Solution : Développer des directives éthiques, clarifier le consentement éclairé avant les tests et fournir un soutien en conseil génétique.

IV. Directions de développement futur

• Intégration technologique : Combinaison séquençage à lecture longue (tels que PacBio) pour analyser des variations structurelles complexes et améliorer la précision diagnostique.
• Surveillance dynamique : Suivi de la progression de la maladie grâce aux biopsies liquides pour orienter le traitement personnalisé.
• Développement de médicaments : conception d'inhibiteurs de petites molécules ou de thérapies géniques basées sur des cibles génétiques pathogènes, telles que des interventions métaboliques ciblant le DHODH.

V. Conclusion

Le séquençage de l'exome entier est devenu un "outil central" dans la recherche sur les maladies rares, jouant un rôle crucial dans le diagnostic, le traitement et la recherche fondamentale en raison de son efficacité et de sa précision élevées. Avec la baisse des coûts technologiques et l'intégration des multi-omiques, il est prévu d'atteindre "un test pour plusieurs usages" à l'avenir, propulsant les maladies rares d'"incurables" à "l'intervention de précision".

Références

1. Liu J, Zheng Y, Huang J, Zhu D, Zang P, Luo Z, Yang Y, Peng Y, Xiao Z, Zhu Y, Lu X. Expansion des génotypes et des phénotypes pour 19 maladies rares par séquençage de l'exome réalisé en unité de soins intensifs pédiatriques.. Hum Mutat. Nov 2021;42(11):1443-1460.
2. Glotov OS, Zhuchenko NA, Balashova MS, Raspopova AN, Tsai VV, Chernov AN, Chuiko IV, Danilov LG, Morozova LD, Glotov AS. Les avantages du séquençage de l'exome complet dans le diagnostic différentiel de l'hypophosphatasieInt J Mol Sci. 31 oct. 2024;25(21):11728.
3. Jung J, Lee JH, Park YS, Seo GH, Keum C, Kang HG, Lee H, Lee SK, Lee ST, Cho H, Lee BH. Maladies rénales ultra-rares diagnostiquées par séquençage de l'exome complet : Utilité dans le diagnostic et la prise en chargeBMC Med Genomics. 3 juil. 2021;14(1):177.