Qu'est-ce que le séquençage CUT&Tag ? Un guide complet pour débutants.

Traditionnel ChIP-seq s'appuie sur des étapes complexes telles que le réticulation au formaldéhyde et la fragmentation ultrasonique, qui souffrent de goulets d'étranglement, notamment des exigences en matière d'échantillons importantes (millions de cellules), de longs cycles expérimentaux (5 à 7 jours) et un bruit de fond élevé, limitant son application dans les échantillons rares (par exemple, les cellules uniques, les tissus de biopsie clinique) et les études sur les protéines à faible abondance.

CUT&Tag La technologie (Clivage sous cibles et Tagmentation) révolutionne la recherche sur la chromatine en fusionnant le ciblage par anticorps avec l'activité de la transposase Tn5 - elle capture directement les fragments d'ADN liés aux protéines cibles sans réticulation, et ajoute simultanément des adaptateurs de séquençage, réduisant les besoins en échantillons à 1000 cellules ou même à des niveaux unicellulaires, et raccourcissant le cycle expérimental à 1 jour.

Cet article vise à analyser systématiquement les principes fondamentaux, les procédures expérimentales, les avantages techniques et les scénarios d'application typiques (modification des histones, localisation des facteurs de transcription) de CUT&Tag pour les chercheurs de base et cliniques, aidant les lecteurs à saisir rapidement la logique sous-jacente et la valeur pratique de cette technologie, tout en fournissant un soutien méthodologique pour réaliser des analyses à haute résolution. recherche épigénétique.

Qu'est-ce que le séquençage CUT&Tag ?

CUT&Tag est une technologie de recherche sur les interactions ADN-protéine guidée par des anticorps. Elle utilise une transposase Tn5 modifiée pour cliver précisément la région d'ADN liée à la protéine cible et ajouter directement des adaptateurs de séquençage, permettant la construction rapide de bibliothèques de séquençage à haut débit. Son principe fondamental est le suivant : en utilisant des anticorps pour reconnaître des protéines spécifiques (comme les modificateurs d'histones ou les facteurs de transcription), le complexe de transposase Tn5 portant l'adaptateur de séquençage est ciblé et lié à la région d'ADN cible. Les ions magnésium activent la transposase pour cliver l'ADN et insérer l'adaptateur, et enfin, l'amplification par PCR produit la bibliothèque de séquençage.

Comparé au ChIP-seq traditionnel, le CUT&Tag élimine le besoin de réticulation au formaldéhyde et de fragmentation ultrasonique, réduisant le cycle expérimental à un jour, tout en offrant un bruit de fond plus faible et un rapport signal sur bruit plus élevé.

Ancrage in situ pour le profilage de la chromatine CUT&Tag (Kaya-Okur HS et al., 2019)

Flux de travail de la technologie CUT&Tag

1. Traitement des échantillons

• Extraction nucléaire : Des cellules vivantes ou des noyaux sont extraits à l'aide de billes magnétiques ConA, et la perméabilité de la membrane nucléaire est améliorée par un traitement de perméation au digitonine.

• Incubation des anticorps : L'anticorps primaire se lie spécifiquement à la protéine cible (par exemple, H3K27me3), et l'anticorps secondaire relie le complexe protéine A/G-Tn5 transposase.

2. Réaction de transposition

• Coupe de l'ADN et ajout d'adaptateurs : L'enzyme Tn5 est activée dans un tampon contenant du Mg²⁺ pour couper la région cible de l'ADN et insérer des adaptateurs de séquençage.

• Purification du fragment : Le fragment d'ADN est purifié par digestion avec de la protéinase K pour éliminer les anticorps et les transposases.

3. Construction de bibliothèques et séquençage

• Amplification PCR : Le fragment d'ADN purifié est amplifié, évitant les étapes de réparation des extrémités et de ligature des méthodes traditionnelles de ChIP-seq.

• Séquençage à haut débit : Le séquençage en paires est effectué à l'aide de la plateforme Illumina pour obtenir les informations de séquence de la région cible.

Flux de travail d'analyse des données

1. Contrôle de qualité et alignement

• Outils de contrôle qualité : FastQC vérifie la qualité du séquençage, MultiQC intègre des rapports multi-indicateurs.

• Paramètres d'alignement : Utilisez Bowtie2 pour aligner au génome de référence, en définissant les paramètres "local" et "très sensible" pour optimiser le taux d'alignement.

2. Appel de Pic

• Sélection d'outil : MACS2 (paramètres recommandés : "nomodel", "shift", "75", "extsize", "150") ou SEACR.

• Étapes clés : Distinguer les signaux de liaison spécifiques du bruit de fond et générer un fichier "narrowPeak".

3. Annotation fonctionnelle et visualisation

• Annotation des gènes : Utilisez ChIPseeker ou bedtools pour associer les positions des pics avec les promoteurs de gènes, les exons et d'autres régions.

• Outils de visualisation : IGV affiche la distribution des pics, et les cartes de chaleur analysent la force de liaison de régions spécifiques (comme les promoteurs).

CUT&Tag vs. ChIP-seq : Une analyse technique comparative

Applications principales de CUT&Tag

1. Analyse des modifications des histones

Détection des modifications des histones à l'échelle du génome (par exemple, H3K27me3, H3K4me1) pour révéler les mécanismes régulateurs épigénétiques du silence ou de l'activation des gènes.

Étude de cas : Shi J et al. ont utilisé la technologie CUT&Tag pour cartographier la distribution génomique à haute résolution de quatre modifications des histones (H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3) à travers sept stades de développement embryonnaire (du bourgeon germinal au stade de la noix). L'analyse de la dynamique de l'état de la chromatine a révélé :

• La dynamique des modifications des histones (par exemple, l'enrichissement de H3K4me3 dans les promoteurs, la marque H3K27ac des enhancers) était très cohérente avec la chronologie des données transcriptomiques, en particulier pendant la ZGA (stade pré-blastocyste), où l'ouverture de la chromatine et l'activation transcriptionnelle étaient synchronisées (augmentation significative de l'expression génique pendant le stade blastocyste).

• Cela a révélé le mécanisme par lequel le reprogrammation des modifications des histones (par exemple, H3K27me3 établi en premier, suivi de l'upregulation de H3K4me1/3 plus tard) et l'activation transcriptionnelle agissent de manière synergique pour conduire le développement dans le développement embryonnaire de L. vannamei.

• La technologie CUT&Tag a pour la première fois révélé un paysage dynamique à haute résolution des modifications des histones durant le développement embryonnaire de L. vannamei, mettant en évidence le mécanisme régulateur synergique entre les transitions d'état de la chromatine et l'expression des gènes, identifiant des gènes clés du développement et des éléments cis-régulateurs, et fournissant le premier cadre épigénétique pour les embryons de crustacés. épigénomiqueréglementation ZGA et recherche en aquaculture.

Évaluation de la qualité de CUT&Tag au stade nauplius III (Shi J et al., 2025)

2. Recherche sur la régulation du génome

Cette recherche révèle la distribution et les changements dynamiques des G4 et des R-loops dans le génome, offrant de nouvelles perspectives sur la structure génomique non classique et la régulation du stress.

Étude de cas : Li C et al., utilisant G4-CUT&Tag et R-loop technologies CUT&Tag, découvert :

• Cartographie de l'ensemble du génome des sites de liaison G4 endogènes : 8195 pics de liaison G4 ont été identifiés dans des cellules HEK293T (méthode d'autobiotinylation G4), avec près de 80 % situés dans des régions promotrices et le reste dans des régions introniques/intergéniques ; ces pics chevauchent fortement les signaux G4-CUT&Tag (72 %) et étaient sensibles aux ligands G4 (comme le TMPyP4).

• Le traitement à l'Hémin améliore la formation de G4 : 2 heures de traitement à l'Hémin ont significativement augmenté la liaison de l'Hémin aux signaux G4-CUT&Tag dans les promoteurs (N=5858) et les amplificateurs (N=612), indiquant que l'Hémin favorise la formation de structures G4 dans des régions spécifiques.

• Les résultats de CUT&Tag des R-loops montrent que le traitement par l'hémine réduit le signal des R-loops de liaison de l'hémine aux promoteurs et aux amplificateurs (réduisant la structure hybride ADN:ARN).

Profilage à l'échelle du génome des sites de liaison de l'hémine utilisant la biotine-PEG4-hémine et la réaction d'auto-biotinylation G4 (Li C et al., 2022)

Recherche de sites de liaison des facteurs de transcription

Localiser précisément les sites de liaison de l'ADN des facteurs de transcription pour élucider leur réseau régulateur sur la transcription des gènes.

Étude de cas : Li Y et al. ont utilisé la technologie CUT&Tag pour analyser les caractéristiques de liaison de la chromatine et les mécanismes régulateurs de LDB1 et de ses facteurs associés. Les principales conclusions sont les suivantes :

• L'analyse CUT&Tag de LDB1 sur six cellules T-CEM a identifié 26 479 pics de liaison de LDB1 :
  • Environ 40 % des pics étaient situés dans des régions promotrices, et environ 60 % étaient situés dans des régions associées aux enhancers (intergéniques ou introniques) ;
  • L'analyse modale de ces pics a montré que les sites de liaison de LDB1 étaient riches en motifs majeurs de facteurs de transcription associés à la progression de la T-ALL (tels que ETS1, RUNX1, GATA3 et MYB).
• Le circuit régulatoire transcriptionnel de base construit dans des échantillons de patients atteints de T-ALL a été validé en utilisant CUT&Tag (basé sur les données ChIP H3K27ac) ;
• La co-localisation de LDB1 avec IRF1, ERG et ETV6 sur la chromatine a été observée, et ces facteurs ont montré une activation transcriptionnelle mutuelle, indiquant que LDB1 est un élément clé du circuit central. L'analyse CUT & Tag d'autres lignées cellulaires de T-ALL (Loucy, Molt-4, J.gamma1) a confirmé que le complexe LDB1 se lie à cet amplificateur, et que cet amplificateur est une région régulatrice clé pour la transcription de MYB (l'expression de MYB diminue et la prolifération cellulaire est inhibée après une interférence CRISPR).

Distribution de la liaison de LDB1 aux régions génomiques dans les 6 cellules T-CEM, évaluée par CUT&Tag (Li Y et al., 2024)

4. Mécanismes de la maladie et dépistage de médicaments

Analyse des caractéristiques de liaison de la chromatine des protéines liées aux maladies pour explorer des cibles thérapeutiques.

Exemple : Zhao H et al., utilisant CUT&Tag-seq (anticorps H2AZ1), RNA-seqet ATAC-seq techniques, la relation entre les motifs de dépôt de chromatine H2AZ1 et la régulation de l'expression génique dans les cellules de cancer du poumon a été révélée. Les principales conclusions sont les suivantes :

• Les pics de liaison H2AZ1 sont fortement enrichis autour des sites de début de transcription (TSS) (environ 40 % dans les régions promoteurs ≤1 kb, 60 % dans les régions liées aux enhancers telles que les régions intergéniques/introniques) ; la liaison est moins fréquente dans les régions du corps des gènes, et presque aucune liaison n'a lieu dans la "région 0" du TSS (région de liaison de l'ARN polymérase II/des facteurs de transcription).

• L'expression génique est significativement augmentée uniquement lorsque H2AZ1 se lie aux régions promotrices ≤1kb ou aux régions 5'UTR ; l'expression génique est diminuée/silencieuse lorsqu'il se lie aux corps des gènes (promoteur 1-3kb, introns, exons, etc.) ou pas du tout.

• L'expression génique était significativement plus élevée lorsque le dépôt de H2AZ1 était combiné à l'ouverture de la chromatine de la région promoteur que lorsque seul H2AZ1 était lié ou que seule la chromatine était ouverte. Les données du TCGA ont validé cette relation comme étant conservée dans le tissu pulmonaire normal et dans le LUAD/LUSC.

• La technologie CUT&Tag a clarifié que le dépôt de H2AZ1 autour du TSS (en particulier dans les régions promotrices ≤1kb) est essentiel à l'expression génique active, et son effet synergique avec l'ouverture de la chromatine régule l'expression génique. Elle a également révélé que H2AZ1 participe à plusieurs voies cancéreuses et peut réguler l'expression génique de manière bidirectionnelle, fournissant de nouvelles perspectives sur les mécanismes épigénétiques du cancer du poumon.

La liaison de H2AZ1 au TSS entraîne une expression génique plus élevée et affecte plusieurs voies de signalisation liées au cancer, comme révélé par CUT&Tag-seq et RNA-seq (Zhao H et al., 2024)

Limitations techniques et solutions

• Limitations :
  • Dépend de la qualité des anticorps ; une liaison non spécifique peut affecter les résultats.
  • Résolution limitée pour des fragments d'ADN très longs (>1 kb).
• Solutions :
  • Priorisez les anticorps de qualité ChIP validés.
  • Compléter les informations sur les longs fragments en les combinant avec ATAC-seq ou MNase-seq.

Conclusion

CUT&Tag, avec son faible montant de départ, sa haute sensibilité et son flux de travail rapide, est devenu un outil important dans la recherche en épigénétique. Que ce soit pour la modification des histones, la localisation des facteurs de transcription ou l'analyse des mécanismes de la maladie, il fournit des cartes d'interaction chromatinienne à haute résolution. Pour les débutants, il est recommandé de commencer par le flux de travail standard et de maîtriser progressivement l'analyse des données et l'interprétation des résultats.

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Qu'est-ce que le séquençage CUT&Tag ?

Séquençage CUT&Tag combine la coupure contrôlée ciblée par des anticorps grâce à une fusion protéine A-Tn5 avec un séquençage ADN massif et parallèle pour identifier les sites de liaison des protéines associées à l'ADN. Il peut être utilisé pour cartographier précisément les sites de liaison de l'ADN pour toute protéine d'intérêt.

Combien de lectures pour CUT&Tag ?

Les bibliothèques doivent être séquencées à une profondeur de 5 à 8 millions de lectures au total. Pour une couverture suffisante, chaque bibliothèque doit générer 3 à 5 millions de lectures uniques (après avoir éliminé les lectures à mappage multiple, les lectures dupliquées, les lectures dans les régions de la liste d'exclusion DAC).

Quelle est la différence entre CUT&RUN et CUT&Tag ?

CUT&RUN utilise Ca²⁺-activé pAG-MNase pour cliver l'ADN tandis que CUT&Tag utilise du Mg²⁺-activé pAG-Tn5 pour cliver l'ADN. Le Tn5 est chargé avec des adaptateurs Illumina qui sont ajoutés à la chromatine pendant le processus de clivage.

Comment fonctionne la tagmentation Tn5 ?

Illumina a développé le protocole de tagmentation, dans lequel une enzyme Tn5 modifiée coupe l'ADN double brin et ligature simultanément les séquences de liaisons nécessaires pour le séquençage Illumina aux deux extrémités.

Quelle est la profondeur de séquençage de CUT&Tag ?

CUT&Tag, la transposase ne coupe la chromatine qu'à proximité immédiate du site de liaison des protéines, ce qui entraîne des longueurs d'ADN plus courtes à séquencer. Cela permet une profondeur de séquençage plus faible (3-5 millions de lectures) pour générer des données robustes, avec un signal de fond inférieur à celui de la plupart des essais ChIP-Seq.

Références

1. Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S. CUT&Tag pour un profilage épigénomique efficace d'échantillons réduits et de cellules uniques. Nat Commun. 2019 29 avr.;10(1):1930.
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