Comment étudier les amplificateurs par séquençage ?

Pour percer les secrets des enhancers, les scientifiques utilisent des techniques de séquençage avancées. Les méthodes de séquençage, telles que ChIP-seq (Immunoprécipitation de la chromatine avec séquençage) et Hi-C (Capture de Conformation Chromosomique à Haut Débit), permettent aux chercheurs de cartographier précisément les emplacements des amplificateurs, d'identifier les gènes cibles et de comprendre leurs mécanismes régulateurs complexes.

Qu'est-ce qu'un amplificateur ?

Les amplificateurs sont des séquences non codantes remarquables résidant dans le génome, et ils détiennent la clé du contrôle de l'expression génique en activant les gènes cibles transcrits par l'ARN polymérase II (ARNpII). Ces éléments essentiels se trouvent principalement dans les régions intergéniques et introniques, certains étant même présents au sein des exons. Dans cet article, nous examinons les caractéristiques des amplificateurs et explorons les méthodologies utilisées pour les étudier à travers des techniques de séquençage.

Amplificateurs génomiques. (Carullo et al., 2019)

• Régulation à distance
  L'un des aspects les plus fascinants des enhancers est leur nature éloignée. Situés typiquement en amont du gène cible à environ -200 paires de bases, les enhancers peuvent renforcer la transcription de promoteurs distants. Ils peuvent même activer l'expression des gènes cibles situés jusqu'à un million de paires de bases de distance. Un exemple emblématique de cela est la relation régulatrice entre le gène Shh de la souris et sa séquence d'enhancer ZRS. ZRS, niché dans le 5ème intron du gène Lmbr1, se trouve à un million de paires de bases de Shh. ZRS orchestre l'expression de Shh en formant une structure en boucle, une illustration classique de la fonctionnalité des enhancers.
• Impact non directionnel
  Les amplificateurs présentent une remarquable non-directionnalité dans leur rôle d'amplificateurs transcriptionnels. Ils peuvent moduler efficacement l'expression des gènes qu'ils soient situés en amont, en aval ou à l'intérieur du gène cible lui-même. Par exemple, un amplificateur contrôlant l'expression spécifique du gène d'Arabidopsis. SUPPRIMEUR LATÉRAL (LAS) est situé à 3,2 kilobases en aval du cadre de lecture ouvert LAS, tandis que le bloc d'activateur C de le LOCUS DE FLORAISON T (FT) le gène est situé à environ 5 kilobases en amont du gène.
• Activité Spécifique aux Tissus
  Les enhancers affichent des niveaux d'activité distincts dans différents types de cellules ou tissus. Cette spécificité est dictée par des facteurs protéiques spécifiques aux cellules ou aux tissus. Par exemple, les enhancers des gènes d'immunoglobulines présentent une activité maximale exclusivement dans les lymphocytes B. Dans les cellules β productrices d'insuline, un facteur protéique spécifique peut activer l'enhancer du gène de l'insuline humaine, favorisant la transcription du gène de l'insuline. Ce facteur est absent dans d'autres types de cellules, rendant l'expression du gène de l'insuline principalement confinée aux cellules β productrices d'insuline.
• Propriétés phasiques
  La fonctionnalité des amplificateurs est étroitement liée à la conformation de l'ADN. La conformation dynamique de l'ADN est essentielle à leur capacité à réguler l'expression des gènes en réponse à divers stimuli.
• Influence des espèces hétérologues
  De manière remarquable, certains amplificateurs peuvent influencer l'expression des gènes à travers les espèces. Des souris portant des amplificateurs HARE5 humains présentent des caractéristiques cérébrales uniques que l'on trouve exclusivement dans les cerveaux humains, avec une taille de cerveau montrant même une augmentation de 12 % par rapport aux embryons de souris portant des amplificateurs HARE5 de chimpanzé. Cette influence inter-espèces met en évidence la polyvalence des amplificateurs dans la promotion de traits spécifiques aux espèces.
• Réactivité aux signaux externes
  Certains amplificateurs sont connus pour être activés par des signaux externes. Par exemple, les hormones stéroïdiennes peuvent activer des amplificateurs spécifiques, et l'amplificateur du gène de choc thermique entre en action à des températures élevées, conduisant à l'expression du gène.

Étude des amplificateurs par séquençage

• Motifs de facteurs de transcription
  Les amplificateurs sont enrichis d'une vaste gamme de motifs de facteurs de transcription (TF). Ces motifs sont des séquences d'ADN spécifiques qui déterminent la liaison des TF, déclenchant l'activation des amplificateurs. Dans diverses espèces, les motifs de TF ont été soigneusement prédits grâce à des techniques avancées telles que ChIP-seq (Séquençage par immunoprécipitation de la chromatine) ou DAP-seq (Séquençage par purification d'affinité de l'ADN)Par exemple, le DAP-seq a réussi à révéler 529 motifs de facteurs de transcription (TF) chez Arabidopsis thaliana, contournant ainsi le besoin d'anticorps spécifiques aux TF des plantes et évitant les défis posés par les faibles niveaux d'expression des TF. Contrairement au ChIP-seq, qui nécessite généralement la construction de plasmides de surexpression pour les protéines cibles marquées, DAP-seq se distingue comme une approche in vitro, éliminant le besoin d'anticorps spécifiques et la rendant adaptée aux espèces végétales sans systèmes de transformation.

Pipeline computationnelle et méthode de sélection des meilleurs PWM d'un TF à partir d'expériences individuelles et du meilleur PWM à travers plusieurs expériences. (Yu et al., 2021)

• Accessibilité de la chromatine
  L'accessibilité de la chromatine, définie par l'occupation des nucléosomes et les interactions des protéines associées à la chromatine, influence profondément la liaison des facteurs de transcription (TF) aux séquences régulatrices. Les éléments cis-régulateurs actifs, tels que les promoteurs et les amplificateurs, se trouvent principalement dans des régions génomiques ouvertes connues sous le nom de régions déficientes en nucléosomes (NDR). Les NDR ont été largement cartographiées à l'échelle du génome dans des espèces comme Arabidopsis thaliana, maïs et riz. Une méthode de pointe appelée ATAC-seq (Analyse de la chromatine accessible aux transposases par séquençage à haut débit) a émergé comme une alternative pratique aux techniques conventionnelles telles que MNase-seq, FAIRE-seq et DNase-seq. ATAC-seq présente de nombreux avantages, notamment sa simplicité, son temps expérimental réduit et ses besoins minimaux en échantillons, ce qui la distingue de ses homologues.
  Veuillez lire l'article. ATAC-Seq – Une méthode pour étudier la chromatine ouverte.

Prédit des amplificateurs à partir d'échantillons cliniques d'ATAC-seq. (Thibodeau et al., 2018)

• Modifications des histones
  les modifications des histones jouent un rôle clé dans la régulation de l'expression génique et l'accessibilité de la chromatine. Dans les régions d'activateurs, les nucléosomes portent des modifications spécifiques des histones qui reflètent leur statut régulateur. Alors que les animaux possèdent des marqueurs d'histones bien caractérisés, tels que H3K4me1 pour les activateurs, H3K9ac, H4K12ac, H3K14ac et H3K27ac pour les activateurs actifs, et H3K27me3 pour les activateurs inactifs, les plantes commencent à dévoiler leurs propres complexités. Les activateurs actifs chez les plantes, comme ceux du pois (PetE) et du maïs (b1), sont enrichis en H3/H4ac et H3K9/K14ac, respectivement. De plus, les NDR intergéniques dans le riz montrent des corrélations avec H4K12ac et H3K27me3. Les recherches sur Arabidopsis ont mis en évidence un lien fort entre les activateurs inactifs et H3K27me3 et une corrélation encore plus prononcée entre les activateurs actifs et H3K27ac. Cela implique que les activateurs actifs chez les plantes présentent couramment une acétylation de H3 et H4, tandis que les activateurs inactifs sont associés à H3K27me3. Pour explorer ces modifications des histones à l'échelle du génome, ChIP-seq reste une méthode largement utilisée.
  Veuillez lire l'article. Comment analyser les données ChIP-Seq : de la prétraitement des données à l'analyse en aval.
• Méthylation de l'ADN
  La méthylation de l'ADN joue un rôle crucial dans la régulation transcriptionnelle tant chez les animaux que chez les plantes. Lorsqu'un activateur présente une méthylation de l'ADN, il peut exercer une influence régulatrice négative sur l'expression des gènes cibles. Des exemples notables incluent la méthylation de l'ADN dans les gènes du maïs. couleur du péricarpe 1 (p1) et b1, et les gènes d'Arabidopsis FLEURISSEMENT WAGENINGEN (FWA), TROP DE BOUCHE (TMB), et FT aux séquences régulatrices, qui agissent toutes comme des suppresseurs de l'expression génique. Chez les humains et les souris, les niveaux de méthylation de l'ADN au sein des amplificateurs sont régulés de manière dynamique et présentent une corrélation négative avec l'activité des amplificateurs. Cela permet de discerner les amplificateurs spécifiques aux tissus. Dans le domaine de la biologie végétale, il est devenu évident que la méthylation de l'ADN des éléments cis-régulateurs est gérée de manière dynamique, ajoutant une couche de complexité aux mécanismes régulateurs des plantes.
  Veuillez lire l'article. Identification des DMC, DMR et DMG dans l'analyse de la méthylation de l'ADN.
  

  La méthylation aberrante de l'ADN dans les régions des amplificateurs dérégule le programme transcriptionnel des néoplasmes myéloïdes. (Ordoñez et al., 2019)

  
  Des niveaux faibles de méthylation de l'ADN servent souvent d'indicateur d'activateurs actifs. L'évaluation des niveaux de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome peut être réalisée efficacement grâce à la technique de Séquençage au bisulfite (BS-seq)Dans le BS-seq, l'ADN est traité avec du bisulfite, un processus qui convertit les résidus de cytosine (C) en uracile (U). Cependant, les résidus de 5-méthylcytosine (5mC) restent résistants à cette transformation. Par conséquent, l'ADN soumis au traitement par bisulfite conserve uniquement la cytosine méthylée. Suivant ce principe, l'ADN génomique est converti par bisulfite, utilisé pour construire des bibliothèques et soumis à un séquençage à haut débit. Le résultat est la capacité de discerner les motifs de méthylation à l'échelle du génome avec une résolution d'une seule base en analysant les transitions C-T dans les lectures séquencées. Le BS-seq a été initialement développé chez Arabidopsis et a depuis trouvé des applications dans plusieurs autres espèces de plantes.
• Interactions de la chromatine
  Les interactions chromatiniennes sont un aspect critique de l'organisation du génome, influençant la régulation des gènes. Des techniques comme la capture de conformation des chromosomes (3C) et ses dérivés (par exemple, 4C, 5C, Hi-C, ChIA-PET, etc.) offrent des aperçus précieux sur ces interactions à travers diverses régions génomiques. Le concept fondamental derrière la technique 3C implique le réticulation de la chromatine avec du formaldéhyde pour préserver la structure tridimensionnelle de la chromatine. Par la suite, la chromatine est clivée à l'aide d'une endonucléase de restriction (comme HindIII, BglII, SacI, BamH ou EcoRI). Cette clivage entraîne la séparation de l'ADN interagissant des gènes non interagissants autour des protéines. Ces interactions conduisent à la formation de deux types de boucles : celles entre les mêmes gènes et celles impliquant des gènes réciproques. La distinction entre ces deux types de boucles est réalisée par une analyse PCR.

En utilisant des techniques comme le 3C et ses dérivés, les chercheurs obtiennent des informations précieuses sur l'organisation spatiale de la chromatine et les interactions dynamiques entre les gènes, offrant une compréhension plus approfondie de la manière dont les gènes sont régulés dans le contexte de leur structure chromatinienne tridimensionnelle.

Références :

1. Carullo, Nancy VN, et Jeremy J. Day. "Les amplificateurs génomiques dans la santé et la maladie du cerveau." Gènes 10.1 (2019) : 43.
2. Yu, Chun-Ping, et al. "Découverte de sites de liaison de facteurs de transcription humains et murins inconnus et de leurs caractéristiques à partir de données ChIP-seq." Actes de l'Académie nationale des sciences 118,20 (2021) : e2026754118.
3. Thibodeau, Asa, et al. "Un modèle basé sur un réseau de neurones prédit efficacement les enhancers à partir d'échantillons cliniques d'ATAC-seq." Rapports scientifiques 8.1 (2018) : 16048.
4. Ordoñez, Raquel, et al. "Méthylation de l'ADN des éléments amplificateurs dans les néoplasies myéloïdes : penser en dehors des promoteurs ?" Cancers 11.10 (2019) : 1424.