Mutation génétique et séquençage

Qu'est-ce qu'une mutation génétique ?

Les mutations génétiques, des altérations du code génétique, peuvent avoir des impacts significatifs sur la croissance et le développement des organismes. Souvent, ces mutations entraînent la perte de la fonction originale du gène, perturbant la relation coordonnée entre les gènes et les processus métaboliques associés. Les conséquences peuvent se manifester par des variations de traits, un développement individuel anormal, une compétitivité réduite pour la survie et la reproduction, ou, dans des cas extrêmes, mener à des mutations létales.

Classification des mutations

Les mutations sont classées en deux types principaux en fonction de leur origine : les mutations spontanées et les mutations induites, chacune résultant de causes distinctes. Les mutations spontanées englobent celles qui se produisent naturellement, entraînées par des facteurs tels que les mutagènes naturels ou les erreurs lors de la réplication et de la réparation de l'ADN. D'autre part, les mutations induites résultent de l'utilisation intentionnelle de mutagènes artificiels. Les mutagènes se présentent sous diverses formes, y compris des mutagènes physiques comme les radiations ionisantes et la lumière ultraviolette, des mutagènes chimiques tels que les nitrites et le bromure d'éthidium, et des mutagènes biologiques comme les rétrovirus.

Une catégorisation supplémentaire des mutations est basée sur les cellules responsables de leur production. Les mutations des cellules somatiques et les mutations des cellules germinales sont deux types principaux. Les mutations des cellules somatiques, qui surviennent dans des cellules non reproductrices, ne se transmettent pas directement à la génération suivante. En revanche, les mutations des cellules germinales, qui se produisent dans des cellules reproductrices, ont une plus grande probabilité d'être héritées par la descendance.

Une autre perspective de catégorisation considère les régions produisant des mutations. Au niveau cellulaire, les mutations chromosomiques impliquent des modifications du nombre et de la structure des chromosomes au sein d'une cellule. Pendant ce temps, au niveau moléculaire, les mutations génétiques impliquent des changements dans la composition et la séquence des bases au sein des gènes.

Caractéristiques de la mutation

La perception des mutations comme nuisibles ou bénéfiques est relative, et dans certains cas, leurs effets peuvent se transformer. Par exemple, une mutation de résistance peut être considérée comme favorable, comme on le voit avec des cultures de mutants nains prospérant dans des environnements venteux et riches en engrais.

• La prévalence et la rareté des mutations génétiques

Les mutations génétiques sont omniprésentes dans le monde biologique, se produisant à la fois chez les organismes inférieurs et supérieurs par des moyens naturels et artificiels. Cependant, dans leur état naturel, les mutations sont exceptionnellement rares, les gènes de type sauvage présentant un taux de mutation très faible.

• Aléa et nature indirectionnelle des mutations génétiques

a. Aléa dans le site : Les mutations génétiques peuvent se produire dans les cellules somatiques et les cellules germinales, les premières n'étant généralement pas transmises à la descendance et les secondes pouvant être héritées. Les mutations peuvent se produire dans différentes parties de la même molécule d'ADN ou dans des molécules d'ADN distinctes au sein d'une cellule.

b. Aléa dans le temps : Les mutations génétiques peuvent se produire à n'importe quel stade du développement biologique d'un individu et peuvent être plus susceptibles de se produire chez les individus âgés, comme les personnes âgées étant sensibles au cancer de la peau.

c. Non-directionnalité : Les mutations génétiques peuvent se produire dans plusieurs directions, entraînant diverses formes alléliques au sein d'un gène.

• Répétabilité et réversibilité des mutations génétiques

a. Répétabilité : Les gènes mutés peuvent subir des mutations supplémentaires de manière indépendante dans des conditions spécifiques, formant de nouvelles formes alléliques à une certaine fréquence.

b. Réversibilité : La direction de la mutation génétique est réversible.

• Parallélisme de la mutation génétique

Les espèces étroitement apparentées subissent souvent des mutations génétiques similaires en raison de leurs bases génétiques relativement proches.

Facteurs d'influence

• Facteurs physiques : Exposition aux rayons gamma, aux rayons ultraviolets, etc.
• Facteurs chimiques : Présence d'analogues de bases, d'aflatoxine, etc.
• Facteurs biologiques : Impact de certains virus et bactéries, etc.
• Altération du nombre, de l'ordre et du type de désoxyribonucléotides au sein d'un gène, entraînant des modifications de l'information génétique.

Technologie de détection des mutations

ARMS-PCR

Le système de PCR par amplification des mutations réfractaires (ARMS-PCR), également appelé PCR spécifique aux allèles (AS-PCR), utilise une approche sophistiquée pour contrôler l'extension spécifique aux allèles grâce à la conception stratégique des amorces en 3' terminal. En intégrant cette conception d'amorces avec le Taqman méthode de sonde, la technologie identifie avec précision à la fois les allèles de type sauvage et les mutations.

Dans le processus PCR ARMS, des nucléotides distinctifs sont incorporés à l'extrémité 3' des deux amorces en amont correspondant à chaque allèle, l'une étant spécifique au type sauvage et l'autre au mutant. Pendant l'amplification, l'amorce en amont qui n'a pas de correspondance parfaite avec le modèle ne parvient pas à former des paires de bases complémentaires, entraînant des incompatibilités, un blocage de l'extension et l'absence de génération de produit PCR. En revanche, le système d'amorces qui correspond précisément au modèle amplifie avec succès les produits PCR correspondants. Les groupes fluorescents attachés aux Proche Taqman générer des signaux détectables, permettant la confirmation du génotype grâce à l'analyse des données de fluorescence. Cette approche méticuleuse garantit l'identification précise des allèles de type sauvage et des gènes mutants dans les échantillons examinés.

PCR d'enrichissement des mutants

La PCR d'enrichissement des mutants est un processus d'amplification en deux étapes conçu pour l'enrichissement ciblé des gènes EGFR mutés. Dans la première étape, le gène EGFR de type sauvage subit une digestion sélective à l'aide d'une endonucléase de restriction. Ce processus enrichit le gène EGFR muté, ouvrant la voie à la seconde amplification par PCR. Par la suite, les produits de PCR sont détectés par électrophorèse, et la détermination du statut de mutation du gène EGFR est effectuée en fonction de caractéristiques spécifiques des produits de PCR, telles que la taille ou la présence/absence.

Comparé à la méthode de séquençage direct, la PCR d'enrichissement des mutants présente une sensibilité et une spécificité accrues dans la détection des mutations d'activation de l'EGFR. Remarquablement, elle peut discerner un gène muté même en présence de 10^3-10^4 copies de type sauvage. Cependant, il est essentiel de reconnaître certains inconvénients inhérents à cette méthode. L'exigence de deux amplifications PCR et de la digestion enzymatique rend la procédure complexe, chronophage et sujette à la contamination. Malgré ces défis, sa sensibilité et sa spécificité accrues font de la PCR d'enrichissement des mutants un outil précieux pour la détection précise des mutations du gène EGFR.

Séquençage de Sanger

Séquençage de Sanger se distingue comme l'une des méthodes les plus largement utilisées pour la détection des mutations. Son principe fondamental repose sur l'utilisation de l'ADN polymérase, des amorces, des dNTP et l'omission stratégique d'un ddNTP aléatoire pendant le processus d'amplification PCR. Ce ddNTP, agissant comme un substitut des dNTP, participe à la réaction de synthèse de la chaîne d'ADN, s'incorporant de manière aléatoire dans la chaîne d'ADN à des positions spécifiques, entravant ainsi l'extension continue de la chaîne d'ADN.

Grâce à cette approche, une série de fragments d'ADN de longueurs variées est générée. Ces fragments sont ensuite marqués par fluorescence et soumis à une séparation électrophorétique, ce qui donne lieu à des bandes fluorescentes distinctes. Le résultat final est l'identification du fragment d'ADN contenant le site de mutation. Séquençage de Sangerla précision réside dans sa capacité à produire un profil complet des fragments d'ADN, permettant la localisation précise des mutations au sein des brins d'ADN séquencés.

Séquençage par pyrophosphate

Le séquençage par pyrophosphate représente une avancée de pointe dans la technologie d'analyse des séquences d'ADN. Le principe sous-jacent implique une approche de séquençage distinctive où, à chaque cycle de réaction de séquençage, un seul type de dNTP est introduit. Si ce dNTP spécifique s'apparie avec le modèle, la polymérase l'incorpore dans le brin d'ADN nouvellement synthétisé, libérant le groupe pyrophosphate (PPi). À travers une cascade de réactions de chimiluminescence enzymatique, le PPi est converti en un signal visible, dont l'intensité est directement proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés dans la réaction.

Cette technologie permet la détermination rapide et précise de courts fragments cibles sans avoir besoin d'électrophorèse ou de marquage fluorescent des fragments d'ADN. Malgré son efficacité, il convient de noter que le séquençage par pyrophosphate n'a pas encore atteint le même niveau de popularité que le séquençage direct. Cela est principalement attribué à sa longueur de lecture limitée et à sa susceptibilité à la contamination. Néanmoins, sa méthodologie unique en fait une alternative prometteuse pour certaines applications dans l'analyse des séquences d'ADN.

Séquençage de nouvelle génération (NGS)

Avancées dans Séquençage de nouvelle génération (NGS) l'a propulsé en tant que force transformative, offrant trois avantages clés par rapport au séquençage Sanger traditionnel. Ces avantages incluent un haut débit, la substitution des fragments d'ADN clonés bactériens par des bibliothèques d'ADN polyvalentes, et l'élimination de l'électrophorèse du processus de séquençage. Ce changement de paradigme réduit considérablement le temps et les coûts de main-d'œuvre associés au séquençage.

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Au cours des deux dernières décennies, NGS a suscité une large popularité, notamment pour son rôle clé dans l'identification de nombreuses mutations et variantes chromosomiques liées aux maladies. Dans le domaine des mutations génétiques liées aux maladies, le séquençage de nouvelle génération (NGS) a propulsé la recherche sur le cancer et le diagnostic clinique dans l'ère génomique, réalisant la vision de la médecine personnalisée basée sur les caractéristiques des mutations tumorales.

Les applications du NGS dans les cliniques de cancérologie englobent un éventail de techniques, y compris séquençage du génome entier (SGE)séquençage de l'exome entier (WES) séquençage de panneaux de gènes ciblés (TS), séquençage du transcriptome, séquençage épigénétique et séquençage monophasique. Distinctions entre WGS, WES et TS proviennent principalement de leurs niveaux de couverture. Le WGS couvre de manière exhaustive l'ensemble du génome à un taux d'environ 95%-98%, tandis que le WES et le TS capturent et séquencent sélectivement des fragments d'ADN provenant de tout l'exome ou de gènes cibles spécifiques, respectivement. Étant donné qu'environ 2% du génome humain est constitué de séquences codantes, WES et TS améliorent stratégiquement la profondeur de séquençage de manière rentable, tout en préservant la précision et l'efficacité.

La majorité des applications NGS liées au cancer adoptées commercialement tirent parti de la méthode TS pour acquérir des séquences de gènes liés au cancer ou obtenir des informations épigénétiques. L'évolution continue et l'adoption généralisée des théories et technologies de détection NGS liées au cancer ont élargi ses applications pratiques à différentes phases cliniques. Ces applications incluent désormais le dépistage précoce du cancer, la détection de la maladie résiduelle minimale (MRD) postopératoire, et des diagnostics simultanés pour les patients confrontés à des cancers avancés.

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Technologie de séquençage à lecture longue de molécules uniques

L'innovant technologie de séquençage à long lecteur de molécules uniques présente des avantages significatifs dans la détection des mutations génétiques, en particulier en excelling dans l'analyse des "séquences difficiles" qui posent des défis pour les techniques conventionnelles. Cela peut inclure des répétitions en tandem (STR) riches en GC et des STR composés de motifs de séquences répétitives qui s'écartent du génome de référence.

Une force clé du séquençage à long lecteur de molécules uniques réside dans sa capacité à contourner l'amplification par PCR, permettant une couverture complète de l'ensemble de la région génomique, en particulier dans les zones amplifiées de manière répétée. Cette approche garantit une exploration approfondie de l'ensemble de la région d'amplification des répétitions sans les limitations associées à la PCR. De plus, la technologie fournit des résultats plus complets, englobant l'intégralité des séquences répétées, des détails sur les longueurs des répétitions amplifiées, le nombre d'unités répétées et leur distribution.

La haute résolution de cette technologie est particulièrement remarquable car elle fournit des informations précises sur les séquences interrompues près des répétitions causant des maladies. Ces interruptions peuvent servir de marqueurs précieux pour le traitement et le pronostic des maladies. En conséquence, technologie de séquençage à lecture longue de molécules uniques est anticipé pour jouer un rôle clé dans le diagnostic moléculaire lié aux anomalies d'amplification des STR. Son application promet une sensibilité et une spécificité accrues pour les maladies dynamiques, offrant aux patients et à leur descendance des informations diagnostiques et thérapeutiques plus détaillées.