Comment préparer des échantillons pour le séquençage de l'ARN des exosomes : un guide étape par étape

Introduction : Un projet réussi d'ARN exosomal commence par la bonne préparation d'échantillons.

Dans séquençage de l'ARN exosomalLe point de défaillance le plus courant n'est pas la construction de la bibliothèque ou l'analyse des données, mais l'échantillon.

Malgré les avancées des technologies RNA-Seq, une préparation d'échantillon médiocre reste une des principales raisons d'échecs ou de résultats suboptimauxEn fait, les audits internes de contrôle qualité et la littérature publiée suggèrent que plus de 50 % des échecs d'échantillons retracez les erreurs dans la gestion précoce, y compris la collecte inadéquate, la dégradation pendant le transport ou la contamination par de l'ARN libre de cellules (cfRNA).

Pourquoi l'ARN exosomal (exoARN) est-il si vulnérable ?

Faible abondanceL'exoRNA est présent en quantités de nanogrammes, voire de picogrammes.

Taille de fragment petiteLa plupart des exoARNs sont courts, en particulier les miARN, qui sont facilement perdus lors de l'extraction.

Susceptibilité à la dégradationDes retards dans le traitement ou une congélation inadéquate peuvent endommager irréversiblement la qualité de l'ARN.

Sensibilité à la contaminationContrairement à l'ARN intracellulaire, la préparation d'exoARN doit faire face à des ARN libres, des protéines et des lipides dans les biofluides.

C'est pourquoi une préparation d'échantillon appropriée n'est pas un détail mineur—c'est le la fondation de votre projet entierQue vous planifiez une étude de découverte de biomarqueurs, une investigation mécanistique ou que vous validiez simplement des transcrits associés aux vésicules, préparer correctement vos échantillons garantit que vous obtiendrez des données fiables dès la première fois.

Cet article fournit un guide standardisé, étape par étape pour vous aider :

• Choisissez le bon type d'échantillon pour votre étude.
• Évitez les pièges courants dans la collecte et la préservation.
• Décidez si vous souhaitez isoler les exosomes vous-même ou soumettre des biofluides bruts.
• Préparez vos échantillons pour soumission à notre installation de séquençage.

En suivant ces directives, vous réduirez les retards, améliorerez la qualité des données et resterez sur la bonne voie vers vos objectifs de recherche.

Si vous débutez dans les flux de travail des exosomes, commencez ici : Protocole d'isolement des exosomes pour l'extraction de miARN

Étape 1 : Choisissez le bon type d'échantillon

Tous les biofluides ne sont pas également adaptés à l'analyse de l'ARN exosomal. Le succès de votre projet RNA-Seq commence souvent par le choix du type d'échantillon qui correspond à vos objectifs de recherche, à vos exigences d'entrée et à vos attentes en matière de rendement en ARN exosomal.

Voici une comparaison des types d'échantillons couramment utilisés dans les études sur l'ARN exosomal :

Plasma (EDTA)

Pourquoi c'est préféréLe plasma collecté avec EDTA est la norme d'or dans la recherche sur l'ARN exosomal en raison de son rendement élevé en vésicules et de sa compatibilité avec le profilage à la fois de l'ARNmi et de l'ARNm. Il est également relativement stable et bien documenté dans les études.

Meilleur pourRecherche sur le cancer, surveillance immunitaire, modèles de maladies infectieuses et développement général de biopsies liquides.

Évitez les tubes contenant de l'héparine.—l'héparine résiduelle inhibe les flux de travail PCR et NGS en aval.

Urine

Pourquoi c'est utileL'urine est facile à collecter de manière non invasive et est riche en vésicules provenant des reins et des voies urinaires. Cependant, la teneur en exoARN a tendance à être inférieure à celle du plasma, et l'urine est plus susceptible à la dégradation.

Meilleur pour: Études axées sur la fonction rénale, les syndromes métaboliques ou l'exploration de biomarqueurs non invasifs.

Salive

Avantages et inconvénientsBien qu'il soit facile à collecter et convivial pour les patients, la salive se dégrade rapidement et contient de nombreuses RNases. De plus, elle présente un rendement variable en exosomes selon les individus et les moments.

Meilleur pourÉtudes de faisabilité ou applications de niche où d'autres fluides ne sont pas disponibles.

Surnageant de culture cellulaire

Pourquoi c'est idéalLes exosomes provenant des milieux de culture sont d'une pureté élevée, avec un minimum de bruit de fond provenant de l'ARNcf ou des protéines plasmatiques. Les chercheurs peuvent contrôler le timing, les conditions de stress et les expositions aux médicaments.

Meilleur pourÉtudes mécanistiques, tests de médicaments, analyse de voies et expériences chronologiques in vitro.

Choisir le bon échantillon donne le ton à l'ensemble de votre projet. Dans la section suivante, nous allons plonger dans meilleures pratiques pour la collecte et la préservation des échantillons—une étape cruciale pour maintenir l'intégrité de l'exoARN.

Étape 2 : Meilleures pratiques pour la collecte et le stockage des échantillons

L'ARN exosomal est très sensible à la dégradation, à la contamination et au stress environnemental. Assurer une manipulation appropriée dès le moment de la collecte des échantillons est essentiel pour maintenir l'intégrité de l'ARN et garantir des résultats de séquençage de haute qualité.

Cette section présente les principales choses à faire et à ne pas faire pour l'échantillonnage, le stockage et le transport, basées sur les meilleures pratiques établies dans la recherche sur les exosomes et validées à travers des centaines de projets réussis.

Directives générales

Utilisez toujours des consommables stériles et sans RNase. pour les tubes, les pointes de pipette et les filtres. La contamination par les RNases est une cause majeure de dégradation de l'exoARN.

Étiquetez les échantillons clairement. avec des marqueurs étanches ou des autocollants imprimés qui résistent au gel. Évitez le ruban adhésif qui se détache à −80°C.

Pour les échantillons de plasma

Tube recommandéEDTA (bouchon lavande).

Évitez l'héparine, elle interfère avec la PCR et la préparation de la bibliothèque.

Délai de traitement: Centrifuge à l'intérieur 2 heures de collecte séparer le plasma des cellules sanguines. Des retards peuvent entraîner une augmentation de la libération de cfRNA des cellules lysées.

Aliquot immédiatement dans des cryotubes (200–500 µL par tube). Ne pas recongeler le plasma décongelé.

Pour l'urine, la salive et le surnageant de culture

UrineCentrifuger pour éliminer les cellules et les débris dans l'heure. Ajouter des conservateurs si un retard est prévu.

SaliveUtilisez des kits de collecte comprenant des inhibiteurs de RNase et congelez immédiatement.

Milieu de culture cellulaireCollectez le surnageant à des moments prédéfinis, centrifugez à 2 000–3 000 g pour éliminer les débris cellulaires, et filtrez si nécessaire.

Recommandations de stockage

Température: Conservez tous les échantillons à −80 °CUtilisez des cryotubes adaptés aux températures ultra-basses.

AliquotageDivisez en volumes à usage unique pour éviter les cycles de gel-dégel.

Temps de maintien maximum: Pour de meilleurs résultats, soumettez des échantillons dans les délais. 4 à 6 semaines de la collection si elle est stockée correctement. Les échantillons plus anciens peuvent nécessiter une pré-évaluation de la QC.

Expédition et Transport

Méthode préférée: Expédier sur glace carbonique, en utilisant des conteneurs isolés en mousse.

Emballage:

Couche 1 : Cryovials à l'intérieur d'un sac en plastique scellé

Couche 2 : Sac placé dans une boîte scellée secondaire (par exemple, tubes coniques de 50 mL)

Couche 3 : Tous les matériaux emballés dans de la glace carbonique à l'intérieur d'un expéditeur isolé en mousse.

Inclure un manifest détaillé avec des noms d'échantillons, des volumes et des dates de collecte.

Suivre ces meilleures pratiques aide à garantir que vos échantillons arrivent intacts et que l'ARN que nous extrayons est adapté à l'analyse en aval, que vous cibliez de petits ARN comme les miARN ou des transcrits complets.

Ensuite, nous allons expliquer votre deux options pour soumettre des échantillons: biofluide brut ou exosomes pré-isolés.

Étape 3 – Préparez votre propre ARN exosomal : Ce que vous devez savoir avant la soumission

CD Genomics se spécialise dans les services de séquençage d'ARN exosomal et demande aux clients de soumettre ARN exosomal déjà extrait et purifiéNous ne proposons pas de services d'isolement d'exosomes ni d'extraction d'ARN. Pour garantir le succès de votre projet, veuillez respecter les exigences de soumission suivantes.

Ce que vous devez soumettre

Type d'échantillonARN exosomal purifié, exempt de protéines, d'ADN et d'inhibiteurs enzymatiques.

QuantitéMinimum de 20 ng par échantillon.

ConcentrationAu moins 1 ng/µL.

Pureté:

Le rapport OD260/280 entre 1,8 et 2,2.

Le rapport OD260/230 ≥ 2,0.

IntégritéNuméro d'intégrité de l'ARN (RIN) ≥ 6,5.

Tampon d'élutionEau sans RNase ou 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), sans EDTA ni autres inhibiteurs.

StockageConserver à -80°C ; éviter les cycles de congélation-dégel répétés.

Référence : Directives de soumission d'échantillons de CD Genomics

Ce qu'il faut éviter

Pour prévenir les problèmes qui pourraient compromettre vos résultats de séquençage :

Ne pas soumettre:

Fluides biologiques entiers (par exemple, plasma, urine, salive ou surnageant de culture cellulaire).

Exosomes non traités ou pellets de vésicules.

Éviter

Tampons d'élution contenant des concentrations élevées de sel, SDS, guanidinium ou résidus de phénol.

Des tampons avec EDTA, car cela peut inhiber les réactions enzymatiques en aval.

Cycles répétés de gel-dégel des échantillons d'ARN. Si vous avez des doutes sur la composition de votre tampon ou votre méthode d'extraction, veuillez nous contacter pour un contrôle de compatibilité gratuit avant la soumission.

Pratiques recommandées d'isolement et d'extraction

Bien que CD Genomics ne soutienne pas de marques spécifiques, nous vous recommandons d'inclure dans votre flux de travail :

Isolation des exosomesUtilisez l'ultracentrifugation, la précipitation par polyéthylène glycol (PEG) ou des méthodes basées sur l'affinité.

Extraction d'ARNUtilisez des protocoles optimisés pour les petits ARN, en veillant à minimiser le transfert de solvants organiques.

Contrôle de la qualitéÉvaluez l'intégrité de l'ARN à l'aide d'un Bioanalyzer ou d'un TapeStation pour confirmer les valeurs de RIN.

Documentation requise

Lors de la soumission de vos échantillons, veuillez fournir :

Un bref résumé de vos protocoles d'isolement des exosomes et d'extraction d'ARN.

Détails de la composition du tampon utilisé dans l'échantillon final d'ARN.

Mesures de concentration et les méthodes utilisées.

Cette information nous aide à évaluer la compatibilité des échantillons et à optimiser votre stratégie de préparation de bibliothèque.

Questions Fréquemment Posées (FAQ)

Quelle est la quantité minimale d'ARN requise pour le séquençage ?

Nous recommandons un minimum de 20 ng d'ARN total par échantillon, à une concentration de ≥1 ng/µLPour les petits ARN ou les workflows à faible entrée, veuillez nous contacter pour une évaluation de faisabilité.

Puis-je envoyer des biofluides bruts ou des exosomes isolés ?

Non. CD Genomics n'accepte que l'ARN exosomal purifié. Veuillez extraire l'ARN avant la soumission. Pour les recommandations d'extraction, veuillez vous référer à notre Guide de Soumission d'Échantillons.

Quel tampon devrais-je utiliser pour resuspendre mon ARN ?

Utilisez de l'eau sans RNase ou une solution de Tris-HCl à 10 mM (pH 8,0). N'utilisez pas de tampons contenant de l'EDTA, du phénol, du guanidinium ou une forte concentration en sel, car ils peuvent inhiber les enzymes en aval.

Proposez-vous des services d'intégrité et de quantification de l'ARN ?

Oui. Tout l'ARN soumis subit un contrôle qualité par Bioanalyzer ou TapeStation (RIN ≥6,5 recommandé), ainsi que des vérifications de concentration et de pureté via NanoDrop et Qubit. Vous recevrez un rapport de contrôle qualité complet.

Pouvez-vous travailler avec de l'ARN dégradé ou à faible entrée ?

Nous évaluons les échantillons dégradés ou à faible apport au cas par cas. Si votre échantillon est en dessous des seuils standards, veuillez nous contacter à l'avance pour une consultation technique gratuite.

J'ai utilisé un kit d'extraction d'ARN commercial - cela va-t-il fonctionner ?

Dans la plupart des cas, oui. Cependant, veuillez partager votre méthode d'extraction et les détails du tampon pour nous aider à évaluer la compatibilité. Certains kits commerciaux laissent des résidus inhibiteurs qui doivent être évités.

Comment devrais-je emballer et expédier des échantillons d'ARN ?

Conservez l'ARN à -80 °C et expédiez-le sur de la glace carbonique, en utilisant des tubes étanches dans un conteneur isolé à trois couches. Évitez les cycles de congélation-dégel répétés.

Conclusion : Des échantillons de haute qualité produisent des données de haute qualité.

Dans le séquençage de l'ARN exosomal, la qualité de vos données n'est aussi bonne que celle de votre préparation d'échantillonsDu choix du bon biofluide à l'assurance d'un stockage approprié et d'une compatibilité des tampons, chaque détail compte. Une mauvaise manipulation peut entraîner un faible rendement, une forte dégradation ou des résultats inutilisables, gaspillant ainsi un temps et un budget précieux.

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