Protocole d'isolement des exosomes pour l'extraction de miARN

Isolation d'exosomes à partir de milieux conditionnés

1. Collecter le milieu conditionné.
2. Centrifuger à 500 g (RCF) pendant 10 min à 4 °C, avec une accélération maximale (stable tout au long du protocole) et une décélération maximale (jusqu'à l'étape 9). Cela permet d'éliminer les cellules vivantes.
3. Retirez le surnageant dans de nouveaux tubes. Sans perturber ou toucher le culot, recueillez tout le milieu au-dessus de la ligne mentionnée, puis pipettez-le dans un nouveau tube.
4. Répétez les étapes 2 et 3.
5. Centrifuger à 2000 g pendant 15 minutes à 4 °C, puis transférer le surnageant dans de nouveaux tubes. Cela permet d'éliminer les cellules mortes.
6. Répétez l'étape 5.
7. Centrifugez à 10 000 g pendant 30 minutes à 4 °C, puis transférez le surnageant dans de nouveaux tubes. Cela permet d'éliminer les débris cellulaires et les vésicules de grand diamètre.
8. Répétez l'étape 7.
9. Centrifugez le surnageant à 100 000 g pendant 1 h à 4 °C, en réduisant la puissance de freinage. Si vous utilisez des machines de nouvelle série (comme l'Optima XPN ou XE), réglez la décélération sur "5" ; en cas de machines de série précédente (comme l'Optima L), réglez sur "frein lent".
10. Retirez soigneusement la majeure partie du surnageant (en tenant toujours compte de la ligne claire avant la partie arrondie du tube) à l'aide d'une pipette de grand volume tout en utilisant une pipette de 1 mL en atteignant le culot. Laissez 2/3 mL de surnageant pour un meilleur stockage de vos vésicules.
11. Ajoutez du PBS pour laver votre préparation d'exosomes afin d'éliminer les contaminants.
12. Centrifugez à 100 000 g pendant 1 h à 4 °C, en réduisant la puissance de freinage. Si vous utilisez des machines de nouvelle série, réglez sur "10" ; en cas de machines de série précédente, réglez sur "sans frein".
13. Éliminez le surnageant comme à l'étape 10.
14. Resuspendre le culot dans environ 200 μL de PBS.

Microscopie électronique

À partir de 200 μL de préparation d'exosomes, 25 μL sont resuspendus dans 275 μL de PBS citrate à 0,32 % pour atteindre un volume final de 300 μL.
2. Diluez 150 μL d'exosomes dans 150 μL de paraformaldéhyde à 4 %, atteignant ainsi une concentration finale de 2 %. Cette étape permet de fixer vos vésicules.
3. Incuber pendant la nuit à 4 °C.
4. Appliquez 10 μL de vésicules fixées sur des grilles EM recouvertes de carbone/formvar pendant 7 minutes.
5. Teindre avec de l'acétate d'uranyle à 2 % pendant 30 minutes à température ambiante.
6. Laissez les vésicules déshydrater pendant 2 h à température ambiante.
7. Image avec TEM à 100 kV.

Analyse du contenu des exo-miARN

1. Resuspendre la préparation d'exosomes dans 1 mL de réactif TRIzol. Agiter vigoureusement, vortexer et conserver à −80 °C pendant la nuit.
2. Décongelez les échantillons à température ambiante, ajoutez 200 μL de 2-bromo-3-chloropropane (ou de chloroforme), et vortexez le tube vigoureusement. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
3. Centrifuger à 12 000 g pendant 15 min à 4 °C.
4. Transférez la phase aqueuse dans un nouveau tube.
Ajoutez 500 μL d'alcool isopropylique froid et vortexez vigoureusement.
6. Congeler à −80 °C pendant 1 h.
7. Centrifuger à 12 000 g à 4 °C.
8. Retirez l'alcool isopropylique (autant que possible) et ajoutez 1 mL d'éthanol à 75 % froid dans de l'eau traitée au DEPC.
9. Centrifugez à 7500 g pendant 5 minutes à 4 °C.
10. Retirer l'éthanol (autant que possible).
11. Séchez le granulé à 42 °C jusqu'à ce qu'il soit sec.
12. Resuspendre le culot dans 15 μL de H traité par DEPC.₂O (ou eau sans RNase).
13. Quantifiez l'ARN extrait à l'aide du spectrophotomètre NanoDrop 1000.

Contrôle de la qualité de l'ARN

Préparation de gel

Transférez le volume complet (environ 650 μL) de la matrice de gel d'ARN petit dans le réceptacle supérieur d'un filtre centrifuge.
2. Placez le filtre à spin dans une microcentrifugeuse et faites tourner pendant 15 minutes à 10 000 g.
3. Retirez le filtre.
4. Conservez le gel filtré à 4 °C (jusqu'à 1 mois).

Préparation du mélange de teinture en gel

1. Concentré de colorant d'ARN petit vortex pour 10 s et centrifuger.
2. Pipettez 2 μL de colorant dans des microtubes de 0,5 mL sans RNase. La matrice de gel est très visqueuse ; évitez donc le vortexage et pipettez lentement.
Ajoutez 40 μL de gel filtré.
4. Mélangez la solution en pipetant ou en inversant le flacon jusqu'à ce que le mélange soit homogène.
5. Faire tourner le tube à 13 000 g pendant 10 minutes à température ambiante.

Chargement du mélange de teinture en gel

1. Sortez une nouvelle puce d'ARN petit de son sac scellé.
2. Placez la puce sur la station de préparation de la puce.
3. Laissez le mélange gel-teinture s'équilibrer pendant 30 minutes à température ambiante avant utilisation, en le protégeant de la lumière.
Pipettez 9 μL du mélange au fond du puits.
5. Réglez le minuteur sur 60 s et assurez-vous que le piston est positionné à 1 mL.
6. Fermez la station de amorçage des puces.
7. Appuyez sur le piston de la seringue jusqu'à ce qu'il soit maintenu par la puce.
8. Attendez 60 secondes, puis relâchez le piston avec le mécanisme de libération de la puce.
9. Ouvrez la station de amorçage de la puce et pipettez 9 μL du mélange gel-colorant dans chacun des puits marqués "G".

Solution de conditionnement des petits ARN et chargement des marqueurs

Pipettez 9 μL de la solution de conditionnement de petits ARN dans le puits marqué "CS".
2. Pipettez 5 μL du marqueur dans le puits marqué avec une échelle et dans chacun des 11 puits d'échantillons. Ne laissez aucun puits vide pour permettre un bon fonctionnement de la puce. Ajoutez 5 μL de marqueur + 1 μL d'eau déionisée dans chaque puits d'échantillons inutilisés.

Chargement d'échantillons

1. Dénaturation thermique de votre échantillon à 70 °C pendant 2 minutes avant de le charger sur la puce.
Pipettez 1 μL de l'échelle dans le puits marqué du symbole de l'échelle.
3. Pipette 1 μL de chaque échantillon dans chacun des 11 puits d'échantillons.
4. Placez la puce horizontalement dans l'adaptateur du mélangeur vortex et mélangez pendant 60 s à 2400 g.
5. Analysez votre échantillon avec l'analyseur bio Agilent 2100 dans les 5 minutes.

Référence :

1. Erika D A, Annamaria M, Giulia S, et al. MicroARN exosomaux : Méthodes complètes de l'isolement des exosomes à l'extraction des miARN et à l'analyse de pureté[M]//Profilage des MicroARN. Humana, New York, NY, 2023 : 75-92.