Stratégies pour atténuer la contamination ADN courante dans le séquençage microbien

Le domaine de la recherche sur les communautés microbiennes a transformé notre compréhension de la microbiologie, mais le problème omniprésent de la contamination de l'ADN peut compromettre l'intégrité des expériences, depuis l'échantillonnage initial jusqu'à la phase de séquençage final. Les contaminants peuvent infiltrer les échantillons d'ADN à différentes étapes de recherche microbienne, y compris l'extraction d'ADN, l'amplification par PCR et même les réactifs de laboratoire, déformant finalement les résultats. En particulier, la contamination de l'ADN peut être préjudiciable lors de l'étude d'échantillons avec des charges microbiennes minimales, nécessitant des mesures prudentes pour relever ce défi.

Sources de contamination de l'ADN

Les sources potentielles de contamination de l'ADN sont multiples et comprennent de l'eau de qualité biologique moléculaire, des réactifs de PCR et les kits d'extraction d'ADN eux-mêmes. Pour discerner et quantifier les niveaux de contamination, des témoins négatifs, souvent appelés échantillons d'extraction d'ADN "vierges" et d'amplification PCR subséquente, sont régulièrement inclus dans séquençage microbien expériences. Fait intéressant, ces échantillons de contrôle négatif révèlent généralement un éventail d'espèces bactériennes contaminantes, reflétant l'arrière-plan trouvé dans des échantillons d'origine humaine traités avec le même lot de kits d'extraction d'ADN.

Un examen de ces résultats de contrôle négatif révèle souvent des classifications taxonomiques communes à différents lieux de laboratoire. Parmi les contaminants récurrents figurent Acidobactéries Gp2, Burkholderia, Mesorhizobium, et PseudomonasCes similitudes suggèrent qu'il existe des variations dans les niveaux de contaminants entre les laboratoires, pouvant résulter de différences dans les réactifs, les lots de kits ou même des contaminants introduits dans l'environnement du laboratoire.

Résumé de l'attribution taxonomique du séquençage du gène 16S rRNA à partir de cultures pures diluées dix fois et de contrôles. (Salter et al., 2014)

Impact des kits d'extraction contaminés sur les études à faible biomasse

Pour illustrer la gravité du problème, considérons un cas spécifique. Des écouvillons nasopharyngés ont été utilisés pour étudier l'évolution du microbiote nasopharyngé chez les nourrissons. L'analyse en coordonnées principales (ACP) a révélé deux taxons distincts, les échantillons prélevés au cours des six premiers mois de la vie étant clairement distinguables de ceux prélevés à des stades ultérieurs. Cette découverte souligne la corrélation entre la flore bactérienne nasopharyngée et le temps de développement. Cependant, une variable cruciale est apparue lorsque quatre lots différents de kits d'extraction d'ADN ont été utilisés. Le choix du kit a considérablement influencé les caractéristiques de la communauté des échantillons, la majorité des lectures d'échantillons provenant des deux premiers kits utilisés.

Résumé du contenu en contaminants des échantillons nasopharyngés en Thaïlande. (Salter et al., 2014)

Recommandations

Étant donné les implications profondes de la contamination par l'ADN bactérien sur les études microbiennes, en particulier lorsqu'il s'agit d'échantillons de biomasse microbienne faible, un ensemble de recommandations clés émerge :

Cohérence des kits : Pour minimiser la contamination introduite par les kits eux-mêmes, il est fortement conseillé d'utiliser de manière cohérente le même lot de kits d'extraction d'ADN tout au long d'un projet. Cette pratique garantit l'uniformité et élimine le risque de variation des résultats induite par les kits.

Conclusion

La lutte contre la contamination de l'ADN dans séquençage microbien est un effort continu, vital pour la fiabilité et la reproductibilité des études sur le microbiote. En comprenant les sources de contamination, en reconnaissant son impact sur les résultats et en mettant en œuvre des mesures telles que la cohérence des kits, les chercheurs peuvent protéger l'intégrité de leurs recherches sur les communautés microbiennes, même lorsqu'ils traitent des échantillons à faible biomasse microbienne. Cette approche conduira finalement à des résultats plus précis et fiables, faisant progresser notre compréhension de la microbiologie.

Référence:

1. Salter, Susannah J., et al. "Les réactifs et la contamination des laboratoires peuvent avoir un impact critique sur les analyses de microbiomes basées sur le séquençage." BMC biologie 12 (2014) : 1-12.