Applications du séquençage CUT&Tag dans l'épigénétique et la régulation des gènes

CUT&Tag, avec son design unique de clivage ciblé et de construction de bibliothèque in situ, est rapidement devenu un nouveau paradigme dans recherche en épigénétique. Comparé à ChIP-seq, cela élimine le besoin de réticulation croisée et de sonication, ne nécessitant qu'un échantillon de cellule unique pour les expériences, et affiche une amélioration du rapport signal sur bruit de plus de 50 %. Cela fournit un nouvel outil pour élucider les mécanismes des maladies (comme le reprogrammation métabolique du cancer) et la biologie du développement (comme la différenciation des organoïdes).

Cet article vise à passer en revue de manière systématique les principes techniques, les avantages clés et les applications de pointe du CUT&Tag, et, à travers des cas typiques dans la modification des histones, la régulation des facteurs de transcription et les modèles de maladies, à expliquer comment il propulse l'épigénétique d'une "moyenne de population" à une "précision à cellule unique".

Principes techniques et avantages clés

CUT&Tag (Clivage sous cibles et Tagmentation) est une technologie de recherche sur l'interaction ADN-protéine guidée par des anticorps. Elle utilise une transposase Tn5 modifiée pour cliver l'ADN près du site de liaison de la protéine cible et ajouter simultanément des adaptateurs de séquençage afin de construire directement des bibliothèques de séquençage.

• Ses étapes principales comprennent :
  • Ciblage des anticorps : L'anticorps primaire reconnaît la protéine cible (comme les modificateurs d'histones ou les facteurs de transcription), et l'anticorps secondaire renforce le signal avant d'introduire le complexe d'enzyme de fusion Protéine A/G-Tn5.
  • Clivage et Étiquetage Ciblés : L'enzyme Tn5 clive l'ADN au niveau de la région de liaison de la protéine cible et insère des adaptateurs de séquençage, libérant de l'ADN fragmenté dans l'espace extracellulaire, réduisant ainsi considérablement le bruit de fond.
  • Construction et séquençage de bibliothèques : Aucune étape de réticulation ou de sonication n'est requise dans le ChIP-seq traditionnel ; la préparation de la bibliothèque peut être réalisée uniquement par amplification PCR, l'ensemble du processus étant complété en une journée.
• Avantages techniques :
  • Exigences d'échantillon faibles : La quantité de cellules de départ peut être aussi basse qu'une seule cellule (certains schémas optimisés).
  • Rapport signal/bruit élevé : La coupure ciblée réduit la liaison non spécifique, ce qui entraîne plus de 80 % de données efficaces.
  • Haute résolution : Capable de détecter des sites de liaison fins allant de 200 à 500 pb.
  • Large compatibilité : Applicable à divers scénarios de recherche, y compris la modification des histones, les facteurs de transcription et l'accessibilité de la chromatine.

Pour un guide d'introduction détaillé sur le séquençage CUT&Tag, veuillez vous référer à "Qu'est-ce que le séquençage CUT&Tag ? Un guide complet pour les débutants".

Reproductibilité et efficacité de CUT&Tag (Kaya-Okur HS et al., 2019)

Localisation précise des modifications des histones

Les modifications des histones (telles que H3K4me3, H3K27ac et H3K27me3) constituent un mécanisme central de la régulation épigénétique, régulant l'expression des gènes en modifiant la structure de la chromatine. technologie CUT&Tag, par le biais de la liaison ciblée par des anticorps et de la clivage in situ, permet une détection à haute résolution de la distribution des modifications des histones à travers tout le génome, fournissant des "marqueurs moléculaires" cruciaux pour élucider la régulation de l'expression génique.

• Développement d'organoïdes : Duong P et al. ont développé un protocole CUT&Tag amélioré pour vérifier son efficacité dans l'analyse des modifications de la chromatine (en utilisant H3K4me3 comme exemple) pendant la régénération des nageoires chez les poissons zèbres adultes, révélant les changements dynamiques dans la chromatine liés à la régénération. Dans le tissu de nageoire non blessé, CUT&Tag a détecté près de 48 000 sites d'enrichissement en H3K4me3. Pendant la période critique de régénération (2 jours après la régénération), le pic spécifique à la régénération (motif FOS) a gagné en H3K4me3, tandis que le pic spécifique aux tissus non blessés (motif FOX/KLF) a perdu H3K4me3, reflétant la réactivation du programme de développement embryonnaire. L'accessibilité de la chromatine a augmenté dans les régions gagnant en H3K4me3, tandis que l'accessibilité s'est stabilisée dans celles qui le perdaient, régulant de manière synergique la régénération. Ce protocole confirme la haute efficacité de CUT&Tag dans les études épigénétiques sur la régénération, révélant la cohérence et les caractéristiques moléculaires du reprogrammation de H3K4me3 et de la réactivation du programme de développement dans la régénération des nageoires.

• Modifications de cartographie : Zhong Z et al. ont utilisé CUT&Tag technologie pour cartographier la régulation épigénétique à l'échelle du génome de H3K4me3 dans les cellules dermiques (DPC) des chèvres cachemires blanches de Shaanbei. Ils ont découvert que la modification H3K4me3 était principalement confinée à la proximité du site de début de transcription (TSS) ; la distribution des pics chromosomiques montrait une modification répandue et relativement uniforme, avec une intensité du signal ±3 kb au centre du pic présentant une distribution approximativement normale. Cela a clarifié les caractéristiques chromosomiques du pic H3K4me3 (telles que la largeur du pic, l'enrichissement, la signification et la proximité du TSS).

• Identification de cibles spécifiques : Janssens, D.H. a utilisé CUT&Tag pour cartographier les cibles spécifiques aux fusions de diverses protéines de fusion KMT2A (telles que KMT2A–AF9, KMT2A–ENL, etc.), identifiant des sites communs et spécifiques aux sous-types tumoraux de régulation anormale de la chromatine ; les sites de liaison des fusions étaient enrichis en marqueurs de promoteurs actifs (H3K4me3, RNAP2S5p, H3K27ac) et en marqueurs génomiques (H3K4me1, H3K36me3), manquaient de marqueurs de silenciation (H3K27me3/H3K9me3), et certains sites présentaient des caractéristiques bivalentes (H3K4me3+H3K27me3). Le CUT&Tag à cellule unique a montré leur hétérogénéité intercellulaire (suggérant une plasticité de lignée).

Adaptation de CUT&Tag pour une automatisation complète (Janssens DH et al., 2021)

Une analyse détaillée de la régulation des facteurs de transcription

Les facteurs de transcription (TFs) régulent la transcription des gènes en se liant aux régions promotrices ou aux enhancers des gènes, servant de points clés dans la régulation de l'expression génique. La technologie CUT&Tag peut localiser les sites de liaison des TF avec une haute résolution, et combinée avec ATAC-seq (accessibilité de la chromatine) ou RNA-seq (l'expression génique), cela révèle le réseau de régulation génique médié par les facteurs de transcription.

• Mécanisme de maturation folliculaire : Zhang H, utilisant CUT&Tag, a découvert que les biomarqueurs significativement élevés pendant l'ovulation (tels que Cyp11a1 et Star) présentaient un fort signal H3K4me3 au niveau de leurs promoteurs, mais ce signal était absent dans les régions d'activateurs ancrées par H3K27ac, indiquant que l'occupation du promoteur joue un rôle central dans l'accessibilité de la chromatine pendant la maturation folliculaire. CUT&Tag de FoSl2 a révélé que FoSl2 montrait un signal génomique global significativement accru dans les pGC à différents stades de maturation ; le score moyen du motif du pic occupé de manière différentielle était inférieur à celui du pic constitutif, suggérant qu'une expression accrue de FoSl2 peut se lier à des sites de faible affinité. FoSl2 a un taux d'occupation génomique accru, et sa région d'accès activée par GC unique (GAA) chevauche le pic de gain de FoSl2 dans 75 % des ovulations. Elle régule l'ouverture de la GAA et l'expression des gènes en aval, maintient l'état de la chromatine et est un facteur clé dans la maturation des follicules.

• Distribution des cibles à l'échelle du génome d'AtSPL9 chez Arabidopsis : Tao XY et al. ont utilisé les noyaux de pousses âgées de 21 jours pour l'analyse B-CUT&Tag et ont identifié 3183 pics, dont 60 % à 70 % étaient partagés avec les pics des échantillons d'inflorescence. Comparé au ChIP-seq (branches âgées de 14 jours) : le ChIP-seq a produit 5841 pics (correspondant à 4744 gènes), dont 36,1 % (1713 gènes) et 41,1 % (1951 gènes) se chevauchaient avec les gènes cibles des inflorescences et des pousses dans B-CUT&Tag, respectivement, indiquant que la régulation d'AtSPL9 présente des variations spatiales (inflorescence vs. pousse) et temporelles (21 jours vs. 14 jours).

• Dynamique de la récupération de GAF sur la chromatine nouvellement synthétisée : Wooten M et al. ont utilisé le nouveau-né. Technique CUT&Tag pour analyser la liaison de GAF (un facteur de transcription clé pour le développement de Drosophile) à l'ADN nouvellement synthétisé. La récupération globale a montré que 40 % du signal GAF sur l'ADN nouvellement synthétisé se rétablissait rapidement, tandis que le signal restant se rétablissait progressivement sur une période de 4 heures. L'analyse de l'hétérogénéité des sites a révélé deux modèles de récupération différents : les sites de récupération précoce (265 sites) montraient un signal plus faible, des motifs GAF plus courts et des largeurs de pic plus étroites (largeur médiane de 942 pb), enrichis en fonctions liées au cycle cellulaire, et étaient immédiatement occupés après le passage de la fourche de réplication ; les sites de récupération tardive (157 sites) montraient un signal significatif, des motifs plus longs et dégénérés, et des largeurs de pic plus larges (largeur médiane de 1603 pb), enrichis en fonctions liées au développement, et leur signal atteignait son maximum après 4 heures.

• Dépistage des gènes cibles en aval : Gao K et al. ont analysé les sites de liaison génomique du facteur de transcription XBP1s en utilisant la technologie CUT&Tag, identifiant un total de 4723 pics de liaison significatifs. Ils ont constaté que les caractéristiques de liaison étaient principalement dans la région promotrice (près de 70 % des pics étaient situés dans la région promotrice, et 66,48 % des pics étaient à moins de 1 kb de la région promotrice), suggérant que XBP1s exerce principalement son rôle régulateur en se liant directement aux promoteurs des gènes cibles. Des recherches supplémentaires ont révélé que MAP3K2, un gène clé dans la voie MAPK/ERK, est un gène cible direct en aval de XBP1s. La surexpression de XBP1s a considérablement augmenté les niveaux d'ARNm et de protéines de MAP3K2, tandis que l'knockout (KO) de XBP1 a significativement inhibé son expression, clarifiant le mécanisme régulateur épigénétique de l'axe XBP1s-MAP3K2-MAPK/ERK dans l'EMT (Transition Épithélio-Mésenchymateuse) induite par l'endométrite.

CUT&Tag l'analyse révèle les cibles géniques en aval de XBP1s (Gao K et al., 2025)

Hétérogénéité épigénétique à l'échelle unicellulaire

La technologie CUT&Tag à cellule unique, avec sa faible quantité de départ (100-1000 cellules) et sa résolution à cellule unique, résout le problème que le séquençage traditionnel en vrac ne peut pas résoudre concernant l'hétérogénéité cellulaire, révélant les différences épigénétiques entre différentes sous-populations cellulaires dans des tissus complexes.

• Profilage chromatin multimodal : Bartosovic M et al. ont développé la technologie nano-CUT&Tag (nano-CT), qui utilise une protéine de fusion nanobody-Tn5 pour localiser simultanément trois modalités épigénomiques (accessibilité de la chromatine ATAC, marqueur actif H3K27ac et marqueur répressif H3K27me3) à une résolution unicellulaire. Ses avantages incluent des besoins en matériel de départ faibles (25 000 à 200 000 cellules), un nombre de fragments par cellule 16 fois supérieur par rapport au CUT&Tag unicellulaire, et une sensibilité considérablement améliorée. Appliquée à l'analyse des cerveaux de jeunes souris, il a été constaté que la détection multimodale simultanée peut distinguer davantage de types/états cellulaires, résoudre la vélocité chromatinique de la lignée des oligodendrocytes et les vagues répressives H3K27me3, révélant le rôle crucial de la collaboration multimodale dans l'hétérogénéité cellulaire et la dynamique de différenciation.

nano-CUT&Tag (nano-CT) (Bartosovic M et al., 2023)

Optimisation technologique et applications de pointe

Avec les avancées technologiques, le CUT&Tag a été continuellement optimisé, donnant naissance à de nouvelles technologies telles que le CUT&Tag à cellule unique, le CUT&Tag spatial et le CUT&Tag à longues lectures, élargissant ainsi ses limites d'application.

• CUT&Tag à cellule unique : En combinant avec la plateforme à cellule unique de 10x Genomics, cela permet l'analyse des modifications des histones ou des sites de liaison des facteurs de transcription au niveau de la cellule unique, résolvant ainsi le problème que le séquençage traditionnel en vrac ne peut pas résoudre concernant l'hétérogénéité cellulaire.

• CUT&Tag spatial : En combinant avec la technologie de transcriptomique spatiale, cela permet une analyse épigénétique in situ des tissus.

• Long-read CUT&Tag : En combinant avec la technologie de séquençage Nanopore, cela permet une analyse épigénétique en lecture longue, résolvant le problème que le séquençage en lecture courte ne peut pas résoudre dans des régions génomiques complexes (telles que les séquences répétées et les variations structurelles).

Conclusion

Séquençage CUT&Tag la technologie, en tant qu'outil central dans épigénétique et la recherche sur la régulation des gènes, démontre une valeur irremplaçable dans plusieurs domaines, y compris la localisation des modifications des histones, la régulation des facteurs de transcription, l'analyse de l'hétérogénéité des cellules uniques et l'exploration des mécanismes des maladies, en raison de ses avantages tels qu'une faible quantité de départ, un rapport signal sur bruit élevé et une efficacité rapide. Avec l'optimisation continue de la technologie (telles que CUT&Tag à cellule unique, spatiale et à longues lectures), ses limites d'application seront encore élargies, fournissant un outil plus puissant pour la médecine de précision (comme l'immunothérapie des tumeurs et le traitement des maladies métaboliques). À l'avenir, il est prévu que CUT&Tag soit combiné avec d'autres technologies omiques (comme RNA-seq, ATAC-seq et la protéomique) pour réaliser une analyse en chaîne complète de "l'épigénétique-expression des gènes-fonction cellulaire", offrant une perspective plus complète pour révéler l'essence des phénomènes de la vie.

Références

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