Flux de travail en bioinformatique pour le séquençage de génome entier

Aperçu du WGS

Séquençage du génome entier (SGE) fait référence au séquençage à haut débit de l'ensemble du génome, permettant l'analyse des variations entre différents individus, ainsi que l'annotation des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) et des caractéristiques structurelles génomiques. Le séquençage du génome entier (WGS), en raison de sa nature exhaustive, fournit une richesse d'informations au-delà de ce qui est réalisable par le séquençage de l'exome ou le séquençage ciblé, offrant ainsi des avantages uniques.

De plus, les avancées des technologies de séquençage ces dernières années, associées à la réduction continue des coûts de séquençage, ont rendu le séquençage du génome entier (WGS) de plus en plus accessible. Sa supériorité dans l'identification des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), des insertions et des délétions (Indels) souligne encore son importance, faisant du WGS une option de plus en plus privilégiée tant dans les recherches cliniques que fondamentales.

Le séquençage génomique complet (WGS) a la capacité d'améliorer considérablement les connaissances génomiques et de comprendre les mystères de la vie en utilisant les technologies de séquençage génétique les plus avancées. Le WGS peut être utilisé pour l'appel de variants, l'annotation du génome, l'analyse phylogénétique, la construction de génomes de référence, et plus encore. Le WGS tente de couvrir l'ensemble du génome, mais couvre en réalité 95 % du génome en raison de difficultés techniques dans le séquençage de régions telles que les centromères et les télomères. Un autre défi pour le WGS est la gestion des données. À mesure que des ensembles de données plus volumineux deviennent plus accessibles et abordables, l'analyse computationnelle sera le facteur limitant plutôt que la technologie de séquençage. Ici, nous discuterons du flux de travail en bioinformatique pour la détection des variations génétiques dans le WGS afin de vous aider à le traverser.

Flux de travail en bioinformatique pour le séquençage de génome entier (WGS)

Le flux de travail en bioinformatique pour le séquençage du génome entier (WGS) est similaire à celui du séquençage de l'exome entier. Vous pouvez consulter notre article. Flux de travail en bioinformatique pour le séquençage de l'exome entierLe flux de travail en bioinformatique pour le séquençage génomique complet (WGS) se divise en plusieurs étapes : (1) contrôle de qualité des lectures brutes ; (2) prétraitement des données ; (3) alignement ; (4) appel de variants ; (5) assemblage de génome; (6) annotation du génome; (7) d'autres analyses avancées basées sur vos intérêts de recherche, telles que l'analyse phylogénétique.

Figure 1. Flux de travail en bioinformatique du séquençage du génome entier.

Contrôle de qualité et prétraitement des lectures brutes

La pertinence du contrôle de la qualité réside dans son application au séquençage de nouvelle génération (NGS), principalement représenté par Illumina, qui utilise principalement la technique de séquençage par synthèse. La fabrication des nucléotides repose sur des réactions chimiques, permettant une synthèse continue et une extension de la chaîne de nucléotides de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3'.

Cependant, tout au long de ce processus de synthèse, l'efficacité de l'ADN polymérase diminue invariablement en parallèle avec la croissance de la chaîne de synthèse, et sa spécificité commence à décliner. Cela engendre inévitablement un problème : à mesure que nous avançons, le taux d'erreur de réplication des nucléotides s'intensifie. La qualité des données de séquençage influence intrinsèquement notre analyse en aval, signalant l'importance de contrôles de qualité rigoureux.

Les données directement obtenues du séquenceur impliquent tous les nucléotides, indépendamment de leur qualité de séquençage. Elles peuvent également contenir des erreurs et inclure éventuellement des inexactitudes expérimentales. Parmi les étapes de contrôle de qualité, les données de séquençage brutes sont saisies dans un logiciel de contrôle de qualité, où les nucléotides de faible qualité, non séquencés ou mal séquencés sont éliminés. Ces étapes produisent des données de lecture de faible qualité filtrées par QC (données propres).

Les données propres sont donc considérées comme dépourvues d'erreurs de séquençage. Supposons que nos données brutes comprennent des lectures (10 000 unités) ; après l'application du contrôle de qualité, cette quantité se transformera en données propres (8 500 unités).

Les fichiers bruts (fastq) doivent être éliminés des lectures/séquences de mauvaise qualité et des séquences techniques telles que les séquences d'adaptateurs. Ce processus est important pour une détection des variations précise et fiable. FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq) est un outil puissant pour le contrôle qualité des lectures brutes qui génère des résultats de données statistiques, y compris des statistiques de base, la qualité des séquences, les scores de qualité, le contenu des séquences, le contenu en GC, la distribution de la longueur des séquences, les séquences sur-représentées, les graphiques de niveau de duplication des séquences, le contenu en adaptateurs et le contenu en k-mer. Des outils comme Fastx_trimmer et cutadapt peuvent être utilisés pour le rognage des lectures.

Alignement

L'alignement fait référence au positionnement de fragments séquencés courts par rapport à une séquence de génome de référence connue afin de déterminer l'emplacement et les variations potentielles de chaque fragment au sein du génome.

Les alignements peuvent aider à localiser précisément les fragments de séquençage sur le génome de référence, révélant ainsi des régions et des structures spécifiques au sein du génome. Grâce à l'alignement, les différences entre l'échantillon séquencé et le génome de référence aident à identifier les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), les mutations par insertions et suppressions, et ainsi de suite. L'alignement est également une étape critique dans l'annotation des gènes ; il aide à déterminer les régions des gènes telles que les exons, les introns, les promoteurs, les exons et les UTR.

Un génome de référence doit être déterminé. Mash nous permet de comparer les lectures de séquençage générées avec l'ensemble de référence des génomes RefSeq de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq) pour déterminer la distance génétique et les relations. La prochaine étape consiste à mapper les lectures contrôlées en qualité sur le génome de référence. Burrows-Wheeler Aligner (BWA) et Bowtie2 sont deux algorithmes populaires d'alignement de courtes lectures. La sortie de BWA et Bowtie2 est le format standard d'alignement de séquences/carte connu sous le nom de SAM, qui facilite les étapes suivantes. Alternativement, BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) est largement utilisé pour l'alignement local.

Tableau 1. Les programmes informatiques courants pour l'alignement des lectures.

Appel de variantes

Une fois que les lectures sont alignées sur le génome de référence, les variants peuvent être identifiés en comparant le génome de l'échantillon au génome de référence. Les variants détectés peuvent être associés à des maladies ou simplement être du bruit génomique non fonctionnel. Le format d'appel de variant (VCF) est le format standard pour stocker les variations de séquence, y compris les SNP (polymorphismes nucléotidiques simples), les indels, les variants structurels et les annotations. L'appel de variants peut être compliqué en raison du taux élevé de faux positifs et de faux négatifs dans l'identification des SNV et des indels. Les paquets logiciels dans le tableau 2 sont utiles pour améliorer l'appel de variants.

Tableau 2. Les logiciels pour l'appel de variants.

Dans l'analyse de séquençage du génome entier (WGS), la détection des variants dépend fortement du score de qualité des bases de séquençage, car ce score est un standard essentiel (parfois le seul) pour mesurer l'exactitude de nos bases séquencées. La Recalibration du Score de Qualité des Bases (BQSR) construit principalement des modèles d'erreur pour les bases de séquençage grâce à l'apprentissage automatique et effectue des ajustements appropriés à ces scores de qualité des bases.

Enfin, le contrôle de qualité et le filtrage des résultats des variants sont nécessaires. L'objectif du contrôle de qualité est de rejeter les résultats faussement positifs dans la mesure du possible tout en conservant autant de données précises que possible. Le schéma de contrôle de qualité préféré est le GATK VQSR (Réévaluation du Score de Qualité des Variants), qui utilise l'apprentissage automatique pour entraîner un modèle (modèle de mélange gaussien) en utilisant diverses caractéristiques de données, permettant ainsi le contrôle de qualité des données de variants.

Assemblage du génome

Assemblage de novo c'est le processus d'alignement des lectures qui se chevauchent pour former des contigs plus longs (séquences continues plus grandes) et d'ordonner les contigs en échafaudages (un cadre du génome séquencé). S'il existe un génome de référence d'une espèce apparentée, la méthode courante consiste d'abord à générer des contigs de novo, puis à les aligner au génome de référence pour l'assemblage des échafaudages. Une approche alternative est l'algorithme "Aligner-Agencer-Consensus". Cette méthode aligne d'abord les lectures sur un génome de référence étroitement apparenté, puis construit des contigs et des échafaudages de novo.

Tableau 3. Les assembleurs courants pour diverses plateformes de séquençage.

Les utilisateurs peuvent évaluer la qualité des ébauches d'assemblages génomiques ou comparer des assemblages générés par différentes méthodes. Il existe une variété de métriques qui reflètent la qualité de l'assemblage. Seul un assemblage contigu presque complet (environ 90 %) interrompu par de petites lacunes permettra une annotation génomique réussie.

• Taille du génome. Les approches basées sur la valeur C et la fréquence des k-mers peuvent toutes deux déduire la taille du génome.
• Contiguïté d'assemblage. La statistique N50 peut être utilisée pour évaluer la continuité de l'assemblage, qui décrit une sorte de médiane des longueurs des séquences assemblées.
• Précision. Les données de transcriptome constituent une ressource importante pour valider l'exactitude des séquences et corriger les échafaudages. Les approches de génomique comparative peuvent également fournir des indications pour détecter les erreurs d'assemblage et les contigs chimériques.

Annotation du génome

Pour comprendre pleinement la séquence du génome, elle doit être annotée avec des informations biologiquement pertinentes telles que les termes d'ontologie génique (GO), les voies KEGG et les modifications épigénétiques. L'annotation implique deux phases :

(1) Phase computationnelle. Une phase computationnelle comprend le masquage répété, la prédiction de la séquence codante (CDS) et la prédiction des modèles de gènes.

• Masquage des répétitions. Étant donné que les répétitions sont mal conservées entre les espèces, il est recommandé de créer une bibliothèque de répétitions spécifique à chaque espèce en utilisant des outils tels que RepeatModeler et RepeatExplorer.
• Prédiction de CDS. Prédire les CDS en utilisant des algorithmes ab initio.
• Prédiction des modèles géniques. L'alignement des protéines, les transferts de protéines synteniques d'autres espèces, les EST et les données de RNA-seq peuvent fournir une ressource précieuse pour prédire les modèles géniques.

(2) Phase d'annotation. Toutes les preuves mentionnées ci-dessus (prédiction ab initio, ainsi que les alignements de protéines, d'EST et d'ARN) sont ensuite synthétisées en une annotation génétique. De plus, des outils d'annotation automatisés tels que MAKER et PASA sont disponibles pour intégrer et évaluer les preuves. WebApollo peut être utilisé pour modifier l'annotation via l'interface visuelle si quelque chose ne va pas avec les annotations génétiques.

Une fois que l'annotation du génome est évaluée par inspection visuelle, vous pouvez publier les séquences de génome brouillon et l'annotation. Afin de permettre à d'autres d'améliorer l'assemblage et l'annotation du génome, toutes les données brutes doivent être téléchargées. Les bases de données disponibles pour le téléchargement du génome incluent ENSEMBL et NCBI.

Figure 2. Vue d'ensemble du flux de travail en bioinformatique. (Bogaerts et al., 2021)

Autres analyses avancées

Des aspects supplémentaires des résultats de séquençage du génome entier peuvent être analysés, tels que l'utilisation d'outils comme Staramr pour l'identification des génotypes génomiques. Cela inclut le typage séquentiel multilocus (MLST) et le typage séquentiel multilocus du génome de base (cgMLST). De plus, des bases de données comme ResFinder sont utilisées pour la détection des gènes de résistance aux antimicrobiens.

Des outils tels que PlasmidFinder sont utilisés pour détecter les réplicons de plasmides, permettant ainsi d'analyser le type et la distribution des plasmides. L'utilisation d'ABRicate, en conjonction avec des bases de données de facteurs de virulence (comme VFDB), facilite la détection des gènes associés à la virulence bactérienne.

Des logiciels comme Roary sont utilisés pour construire le génome de base et le pan-génome, tandis que des outils tels qu'IQ-TREE aident à développer des arbres phylogénétiques, facilitant l'analyse des relations évolutives entre les souches. Pour visualiser les arbres phylogénétiques et les métadonnées, des outils comme iTOL sont mis en œuvre, générant des rapports facilement compréhensibles.

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Références :

1. Dolled-Filhart M P, Lee M, Ou-yang C, et al. Cadres computationnels et bioinformatiques pour le séquençage de nouvelle génération de l'exome entier et du génome. The Scientific World Journal, 2013, 2013.
2. Ekblom R, Wolf J B W. Un guide de terrain pour le séquençage, l'assemblage et l'annotation du génome entier. Applications évolutives, 2014, 7(9) : 1026-1042.
3. Kwong J C, McCallum N, Sintchenko V, et al. Séquençage du génome entier en microbiologie clinique et de santé publique. Pathologie, 2015, 47(3) : 199-210.
4. Meena N, Mathur P, Medicherla K M, et al. Un pipeline de bioinformatique pour le séquençage de l'exome complet : aperçu du traitement et des étapes des données brutes à l'analyse en aval. bioRxiv, 2017 : 201145.
5. Oakeson K F, Wagner J M, Mendenhall M, et al. Analyses bioinformatiques des données de séquence du génome entier dans un laboratoire de santé publique. Maladies infectieuses émergentes, 2017, 23(9) : 1441.
6. Atxaerandio-Landa A, Arrieta-Gisasola A, Laorden L, et al. Un flux de travail bioinformatique pratique pour l'analyse routinière des données de séquençage génomique bactérien. Micro-organismes29 novembre 2022; 10(12):2364.
7. Bogaerts B, Nouws S, Verhaegen B, et al. Stratégie de validation d'un flux de travail de séquençage du génome entier en bioinformatique pour Escherichia coli producteur de toxine Shiga utilisant une collection de référence largement caractérisée par des méthodes conventionnelles. Génomique microbienne, 2021, 7(3) : 000531.
8. Bogaerts B, Delcourt T, Soetaert K, et al. Un flux de travail de séquençage du génome entier en bioinformatique pour l'analyse des isolats cliniques du complexe Mycobacterium tuberculosis, validé à l'aide d'une collection de référence largement caractérisée par des méthodes conventionnelles et des approches in silico. Journal de microbiologie clinique, 2021, 59(6) : 10.1128/jcm. 00202-21.