Séquençage des phages E. coli : Applications et considérations

Le séquençage des phages E. coli est un outil important pour étudier l'interaction entre les bactériophages et les bactéries hôtes (E. coli). Avec le développement rapide de la technologie génomique, le séquençage des phages E. coli aide non seulement les scientifiques à comprendre les caractéristiques génétiques des bactériophages, mais fournit également une nouvelle perspective de recherche pour la biotechnologie, la médecine et la protection de l'environnement. Cet article discutera des applications des bactériophages E., des défis potentiels et des considérations. Séquençage d'E. coli.

Application principale

Ciblage génomique des pathogènes résistants aux médicaments

Aperçus mécanistiques des phages E. coli O157

• Modèles d'infection spécifiques au groupe : Les isolats du phage T4 ont formé trois clusters génomiques distincts. Chaque cluster a montré une infection préférentielle de souches spécifiques de PT (par exemple, les phages du groupe 1 lysaient systématiquement les variantes PT21/28).
• Corrélation Phénotype-Génotype : Les profils d'infection au sein des clusters ont montré plus de 85 % de similarité, avec une divergence génomique inférieure à 5 % entre les membres du groupe. Le groupe 1 possédait cinq gènes uniques pouvant potentiellement régir la spécificité de l'hôte.
• Implications de la conception de cocktails
  • Ce regroupement permet le développement rationnel de cocktails de phages :
    • Composants universels : Phages largement actifs à travers les clusters
    • Composants spécifiques : Phages ciblant des groupes pour des souches résistantes
• Stratégie de ciblage thérapeutique : Les variations génétiques minimales entre les clusters (en particulier dans les gènes des fibres de queue) représentent des cibles d'ingénierie précises pour un contrôle amélioré de la gamme d'hôtes (Cowley LA et al., 2015).

Validation des candidats thérapeutiques : Cas du phage VE20

Profil de sécurité génomique

Assurance de la sécurité environnementale

• <75 % d'homologie avec des porteurs de gènes de résistance (par exemple, l'isolat d'eaux usées YZ1 avec SUL2)
• Risque minimal de transfert horizontal de gènes

Déterminants moléculaires de l'efficacité thérapeutique

Expansion de la gamme d'hôtes

• Les variations du filament de queue (ORF13-14) permettent la lyse de :
  • 47,05 % des souches cliniques d'E. coli
  • Sérovars de Salmonella enterica

Efficacité de réplication

• Latence courte (10 min) : Déterminée par les gènes de réplication de l'ADN (ORF72-73)
• Taille de bouffée modérée (60 PFU/cellule) : Module de lyse rationalisé (endolysine unique ORF16)

Résilience environnementale

• Thermostabilité (30-60°C) : intégrité structurelle du capside
• Tolérance au pH (3-11) : adaptations de l'enveloppe du virion (Zhong Z et al., 2024)

Le taux de lyse du phage vE20 à différents MOI (Zhong Z et al., 2024)

Phage Myoviridae VB : Caractérisation et potentiel thérapeutique

Isolation et spécificité hôte

Le phage VB (GenBank : MT664721), un membre nouvellement caractérisé de la famille des Myoviridae, démontre une activité lytique directe contre Escherichia coli APEC O78, résistant à plusieurs médicaments. Ce pathogène représente un agent de maladie aviaire majeur avec un potentiel de transmission zoonotique significatif.

Applications thérapeutiques

• Intervention MDR ciblée : Thérapie de précision contre les infections à APEC O78 résistantes aux médicaments chez les volailles et les humains.
  • Spectre antimicrobien étendu
    • Efficacité préliminaire contre des agents pathogènes nosocomiaux critiques :
    • Acinetobacter baumannii
    • Pseudomonas aeruginosa (Deng S et al., 2021)

Biologie synthétique

Cette étude a réussi à concevoir un phage fluorescent, K1F-GFP, ciblant l'Escherichia coli K1 pathogène en utilisant la technologie CRISPR/Cas. Nous fournissons les premiers aperçus mécanistiques de son efficacité à éliminer les pathogènes intracellulaires au sein des cellules humaines.

1. Avancées dans l'ingénierie des phages

• Insertion génique ciblée : En utilisant la recombinaison homologue assistée par CRISPR/Cas, le gène GFP a été précisément intégré dans une région non essentielle du génome du phage, produisant un recombinant stable.
• Optimisation du Capside Fonctionnel : Les défauts associés à la fusion des protéines de capside (par exemple, la réduction de la forme physique due à G10::gfp) ont été surmontés en optimisant la conception des peptides de liaison, permettant l'expression fonctionnelle de protéines fluorescentes.

2. Mécanisme Bactéricide Intracellulaire

• Voie de co-invasion : Le phage K1F-GFP co-entre dans les cellules épithéliales de la vessie humaine T24 par phagocytose aux côtés de sa bactérie hôte (E. coli EV36-RFP), confirmé par la co-localisation avec le marqueur phagosome Rab7.
• Killing intracellulaire amélioré : K1F-GFP réduit significativement la charge bactérienne intracellulaire, démontrant une efficacité bactéricide supérieure de plus de 50 % à l'intérieur des cellules par rapport à l'environnement extracellulaire. La spécificité a été confirmée par l'inaction du phage T7 et contre des bactéries non sensibles.
• Mécanismes de dégradation :
  • Complexes Phage-Bactéries : Dégradés par phagocytose associée à LC3 (validé par la co-localisation avec le marqueur lysosomal Cathepsine L).
  • Phages libres : soumis à une nouvelle voie d'élimination xénophage, indépendante de la voie d'autophagie ubiquitine-NDP52 (Møller-Olsen C et al., 2018).

Phage A221 microencapsulé oral : Efficacité contre la diarrhée des porcelets

Caractérisation des phages

• Classification : famille des Ackermannviridae (sous-famille des Aglimvirinae, genre Agtrevirus)
• Génome : 153 297 pb ADN double brin
• Spécificité de l'hôte : Cible Escherichia coli GXXW-1103
• Efficacité In Vitro : Activité antibactérienne puissante (suppression soutenue ≥16 heures)

Technologie de microencapsulation

• Innovation de base : Une formulation résistante à l'acide gastrique protège la viabilité des phages.
• Mécanisme de livraison : Libération intestinale ciblée

Résultats thérapeutiques in vivo

Référence thérapeutique

Efficacité équivalente à l'antibiotique florfénicol atteinte.

Impact translationnel

• Alternative aux antibiotiques : Efficace contre la diarrhée induite par des MDR
• Agriculture durable : Permet la transition écologique dans la production animale (Mao X et al., 2023)

Effets du phage A221 ou FFC sur les bactéries (Mao X et al., 2023)

Flux de travail de séquençage de phages : cadre technique

1. Traitement des échantillons

• Enrichissement de phages
  • Concentration de virus : précipitation avec PEG8000
  • Purification : centrifugation sur gradient de densité d'iodixanol
• Élimination de l'ADN hôte
  • Digestion enzymatique : traitement à la DNase I
  • Filtration en bioinformatique : Alignement contre le génome d'E. coli K-12

2. Préparation d'acides nucléiques

• Extraction d'ADN
  • Lysis de capsides : méthode CTAB
  • Purification : Chromatographie sur colonne avec membrane de silice

3. Stratégie de séquençage

• Approche à double plateforme
  • Lecture courte : Illumina PE150
  • Lecture longue : Oxford Nanopore PromethION

4. Assemblage et Polissage Hybrides

• Préparation des données d'entrée :
  • Les données de séquençage à lecture courte d'Illumina servent d'entrée pour un assemblage de novo utilisant SPAdes.
  • Les données de séquençage à long terme par nanopore servent d'entrée pour un assemblage de novo utilisant Flye.
• Polissage par assemblage hybride :
  • Les contigs assemblés provenant à la fois de SPAdes (basé sur Illumina) et de Flye (basé sur Nanopore) sont combinés.
  • Ces contigs subissent un polissage itératif avec Racon pour améliorer la précision et résoudre les erreurs structurelles.
• Sortie finale :
  • L'assemblage poli produit des contigs de haute qualité d'une longueur minimale de plus de 100 kilobases (kb), atteignant une statistique N50 (un indicateur selon lequel la moitié de l'assemblage est contenue dans des contigs de cette taille ou plus).
• Technologies clés :
  • SPAdes : Optimisé pour les lectures courtes Illumina.
  • Flye : Conçu pour des lectures longues bruyantes (par exemple, Nanopore).
  • Racon : Un outil de consensus qui affine les assemblages en utilisant à la fois des lectures courtes et longues.

5. Annotation fonctionnelle

• Dépistage à double base de données
  • PHROGs : Fonctions essentielles des phages (réplication, emballage, structure)
  • VFDB : Facteurs de virulence (par exemple, toxine Shiga) et gènes de résistance (par exemple, β-lactamases)

Optimisations techniques clés

Pour une approche plus détaillée du séquençage des phages, veuillez vous référer à "Séquençage du génome de phages : Méthodes, défis et applications.

Pour plus d'informations sur ce qu'est le séquençage de phages, voir "Qu'est-ce que le séquençage de phages ? Un guide complet pour les chercheurs..

Pour plus d'informations sur le protocole de séquençage du génome Lambda, veuillez vous référer à "Séquençage du génome du phage Lambda : Protocoles et cas d'utilisation.

Considérations clés

1. Contrôle des caractéristiques biologiques

• Dépistage obligatoire des gènes de virulence : Les bactériophages codant pour la toxine de Shiga (STX1/2) ou l'entérotoxine (AstA) doivent être exclus de l'utilisation, quelle que soit l'état fonctionnel du gène (par exemple, inactivation).
• Adéquation des phages industriels : Les phages destinés à des applications industrielles nécessitent une évaluation minutieuse pour éliminer les variants lysogènes (par exemple, Lambda *cI+*). Cela permet de prévenir les événements potentiels de transfert horizontal de gènes pendant les processus de fermentation.

2. Surveillance dynamique de la variation de la gamme d'hôtes

Une stratégie d'évaluation périodique, mise en œuvre tous les 10 passages de culture continue, est essentielle :

• Validation de la plage d'hôtes par essai en point : Détecter les altérations dans les spectres de lyse des phages en utilisant une bibliothèque de souches hôtes standardisée, en employant la méthode de l'essai en point. Quantifier les changements dans le diamètre et la clarté des plaques lytiques pour évaluer les excursions de la plage d'hôtes.
• Analyse des mutations à l'échelle du génome :
  • Effectuer séquençage du génome entier(WGS) sur la génération actuelle de phages.
  • Aligner les séquences au génome de référence initial (par exemple, en utilisant BWA-MEM + Samtools) pour identifier les variants, y compris :
    • Polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs) et événements d'insertion/suppression (Indels).
    • Variations structurelles (par exemple, inversions de gènes, amplifications de répétitions).
    • Événements de recombinaison (visualisés via des alignements de génomes circulaires dans des outils comme BRIG).

3. Mise en œuvre technique

• Profondeur de séquençage et contrôle de qualité :
  • Recherche fondamentale : Couverture minimale ≥30x ; score Q30 > 90 %.
  • Applications cliniques/industrielles : Couverture minimale ≥50x ; nécessite un test triple avec révision manuelle de la séquence.
• Contrôle de la contamination :
  • Filtrer tous les réactifs à travers une membrane de 0,22 μm.
  • Inclure des contrôles sans modèle (NTC) dans toutes les procédures pour détecter et prévenir la contamination croisée.

4. Exigences en matière de sécurité et de conformité

• Protocoles de biosécurité :
  • Manipuler des phages portant des facteurs de virulence (par exemple, STX) dans des laboratoires de biosécurité de niveau 2 (BSL-2).
  • La libération environnementale de phages conçus nécessite des barrières de confinement physique triples, telles que des systèmes fermés microfluidiques.
• Gestion de la propriété intellectuelle :
  • Sécuriser des brevets pour les composants essentiels (par exemple, la structure de la protéine GP37 de la fibre de queue du phage JS98).
  • Déposez des souches de phages génétiquement modifiées conformément au Traité de Budapest dans des dépôts internationaux reconnus.

Directives pour des percées de pointe

1. Surveillance en temps réel in situ

Implémenter séquençage par nanopores direct d'échantillons de mucus intestinal, atteignant une résolution à cellule unique sans enrichissement préalable. Cela permet l'observation en temps réel d'interactions critiques, telles que celles entre les phages et Clostridioides difficile.

2. Blocage évolutif de la résistance

Développer des phages assistés par CRISPR-Cas9. Ceux-ci transportent des sgARN conçus pour cibler des gènes de résistance essentiels de l'hôte (par exemple, MEFA). Cette stratégie permet une inactivation à haute efficacité (>98%) des mécanismes de résistance ciblés.

3. Plateforme microfluidique à haut débit

Établir des systèmes microfluidiques intégrés combinant : tri de phages uniques via marquage fluorescent, capacité de séquençage parallèle sur 96 canaux, et imagerie dynamique de lyse en temps réel. Cette plateforme accélère considérablement le pipeline de dépistage pour identifier des phages virulents puissants.

Considérations d'implémentation

Phase de conception

• Statut de la bactérie hôte : Optimiser l'efficacité de l'infection en utilisant des hôtes E. coli en phase de croissance logarithmique (OD600 = 0,4 ± 0,05).
• Représentativité de l'échantillon : Pour les échantillons environnementaux, utilisez des stratégies de collecte multipoints (par exemple, à travers différents emplacements dans un fermenteur) afin de minimiser le biais d'échantillonnage.

Phase d'analyse des données

• Décontamination : Alignez obligatoirement les données de séquence contre le génome de référence E. coli K-12 MG1655 pour identifier et supprimer les séquences contaminantes.
• Contrôle de la contamination : Appliquez rigoureusement des contrôles négatifs tout au long du flux de travail pour détecter et atténuer les problèmes potentiels de contamination croisée.

Conclusion

Séquençage de phages E. coli La technologie détient un potentiel transformateur dans les thérapies ciblées médicales, la surveillance de la sécurité alimentaire et les applications de biologie synthétique. Son déploiement réussi nécessite une attention simultanée à la précision technique (assemblage hybride, profondeur de séquençage suffisante), à des protocoles de biosécurité stricts (par exemple, double révision pour les gènes de virulence) et à l'adéquation spécifique à l'application (par exemple, exclusion des lysogènes dans les environnements industriels). L'intégration du séquençage en temps réel par nanopore avec l'édition dynamique basée sur CRISPR est prête à accélérer les percées dans la lutte contre les bactéries résistantes aux médicaments, redéfinissant fondamentalement le paysage de l'ingénierie microbienne de précision.

Références :

1. Cowley LA, Beckett SJ, Chase-Topping M, Perry N, Dallman TJ, Gally DL, Jenkins C. Analyse du séquençage du génome entier pour les phages de typage Escherichia coli O157:H7. BMC Genomics2015 avr. 8;16(1):271.
2. Zhong Z, Wang Y, Li H, Zhang H, Zhou Y, Wang R, Bao H. Caractérisation et analyse génomique d'un nouveau phage lytique d'E. coli avec une activité lytique étendue contre S. Enteridis et S. Typhimurium.. Processus de production alimentaire et nutrition. 6, 14 (2024).
3. Deng S, Xu Q, Fu Y, Liang L, Wu Y, Peng F, Gao M. Analyse génomique d'un nouveau phage infectant le pathogène aviaire Escherichia coli APEC O78 et son activité endolysine. Virus31 mai 2021 ; 13(6) : 1034.
4. Møller-Olsen C, Ho SFS, Shukla RD, Feher T, Sagona AP. Des bactériophages K1F conçus tuent les Escherichia coli K1 intracellulaires dans les cellules épithéliales humaines.. Sci Rep. 3 déc. 2018; 8(1):17559.
5. Mao X, Wu Y, Ma R, Li L, Wang L, Tan Y, Li Z, Liu H, Han K, Cao Y, Li Y, Peng H, Li X, Hu C, Wang X. Thérapie phagique orale avec des phages microencapsulés A221 contre les infections à Escherichia coli chez des porcelets sevrés. BMC Vet Res2023 Sep 20;19(1):165.