Séquençage du génome du phage Lambda : Protocoles et cas d'utilisation

Le bactériophage Lambda est un virus capable d'infecter E. coli. Son génome est un ADN double brin linéaire, d'environ 48,5 kb, et contient environ 50 gènes. Sa structure génomique est simple et possède une forte adaptabilité. Il est souvent utilisé dans la recherche sur le clonage de gènes, l'expression des gènes et l'édition du génome.

Le phage Lambda est un virus classique largement utilisé dans la recherche en biologie moléculaire, en génomique et en ingénierie génétique. Lambda séquençage du génome de phage La technologie est devenue un outil important pour étudier les caractéristiques et les fonctions de ce phage ainsi que son application dans les expériences de biologie moléculaire. Dans cette revue, nous présenterons en détail les protocoles courants et les cas d'application du séquençage du génome du phage Lambda.

Flux de travail expérimental

Étape 1 : Préparation de l'échantillon et extraction de l'ADN

• Purification du virus :
  • Hôtes d'E. coli infectés incubés à 37°C jusqu'à lyse (transition trouble→clair)
  • Traité avec DNase/RNase pour dégrader les acides nucléiques de l'hôte.
  • Centrifugé pour éliminer les débris cellulaires
  • Phages concentrés par précipitation avec du PEG
  • Purifié par centrifugation sur gradient de CsCl
• Extraction d'ADN :
  • Capsides viraux digérés avec Proteinase K/SDS
  • Acides nucléiques extraits par phénol-chloroforme
  • ADN précipité à l'éthanol resuspendu dans un tampon TE
  • Pureté/intégrité vérifiée par :
    • Spectrophotométrie Nanodrop
    • Électrophorèse sur gel d'agarose (bande caractéristique d'environ 48,5 kb)

Étape 2 : Construction de la bibliothèque

• Fragmentation :
  • ADN fragmenté ultrasoniquement en morceaux de 300 à 800 pb
  • QC critique : Distribution des fragments confirmée par l'Agilent Bioanalyzer
  • Précaution : Éviter la sur-fragmentation près des sites cos.
• Fin de la modification et ligature de l'adaptateur :
  • Réparation des extrémités de fragments :
    • Aplanissement
    • phosphorylation 5'
    • A-tailing
  • Adaptateurs Illumina ligaturés
  • Amplification PCR en cycle limité (≤8 cycles) pour minimiser le biais

Étape 3 : Séquençage à haut débit

• Sélection de la plateforme :
  • Illumina NovaSeq : Applications à couverture profonde
  • Oxford Nanopore : Validation des variants structurels
  • Exigence de couverture : Profondeur minimale de 50× pour un assemblage précis des sites cos/régions répétées.

Étape 4 : Analyse des données

Traitement des données brutes

• Une évaluation initiale de la qualité a été effectuée à l'aide de FastQC, suivie d'un filtrage avec Trimmomatic pour supprimer :
  • Lectures de faible qualité (score Phred <20)
  • Séquences d'adaptateurs
  • Fragments courts (<50 pb)

Alignement et assemblage de séquences

• Alignement basé sur une référence :
  • Lectures mappées par BWA-MEM sur le génome de référence λ (GenBank : J02459)
  • Produire des fichiers SAM/BAM pour une analyse ultérieure.
• Assemblage de novo :
  • SPAdes a généré des contigs à partir de données à lecture unique ou de données de faible qualité.
  • Intégrité structurelle du site cos vérifiée

Analyse de variation et annotation fonctionnelle

• Détection de variantes :
  • GATK HaplotypeCaller a identifié des SNPs/indels.
  • Mutations critiques du site incluses (par exemple, locus ATTP)
• Annotation du génome :
  • Annotation de gènes automatisée Prokka (par exemple, répresseurs CI, clusters de gènes de queue)
  • Validation manuelle des régions régulatrices (promoteurs PL/PR)

Visualisation et Interprétation

• IGV (Integrative Genomics Viewer) examiné :
  • Profils de profondeur de couverture
  • Régions de recombinaison génomique
  • Confirmation de variante structurelle

Considérations techniques clés pour le succès

• Pureté de l'échantillon :
  • La centrifugation sur gradient de CsCl a éliminé la contamination par l'ADN de l'hôte.
  • Vérifié par l'absence de bandes étrangères dans l'analyse électrophorétique.
• Contrôle de la fragmentation :
  • Les paramètres d'ultrasonication optimisés ont préservé les sites cos (cosL/cosR).
  • Prévention de la fonctionnalité de conditionnement de la terminase compromise.
• Synergie des plateformes de séquençage :
  • Illumina a garanti l'exactitude des appels de bases.
  • Nanopore variations structurelles résolues (par exemple, états d'intégration de prophage)
• Validation de l'assemblage :
  • Contig N50 >40 kb (permettant la reconstruction complète du génome)
  • Sites cos flanquants de couverture profonde symétrique

Lambda en action : études de cas

Développement d'outils en biologie moléculaire

• Optimisation de l'ingénierie vectorielle :
  • Intégrité de la séquence vectorielle modifiée vérifiée (par exemple, locus d'insertion λGT11)
  • Assuré une intégration précise de gènes étrangers (par exemple, LacZ)
• Analyse des promoteurs/opérons :
  • Éléments régulateurs précisément cartographiés (par exemple, promoteurs PL/PR, opérons Cro/Ci)
  • Facilite la conception rationnelle de composants biologiques synthétiques.

2. Études sur l'interaction hôte-phage

• Mécanismes de reconnaissance de l'hôte :
  • Analyse comparative de la capacité d'infection entre les souches d'E. coli.
  • Hotspots de mutation localisés dans la protéine J (déterminant d'adsorption de l'hôte) :
    Mutations ponctuelles
    Suppressions
• Conversion lysogénique :
  • Statut d'intégration annoté de l'attP dans le génome hôte
  • Analyse des dynamiques de régulation de l'expression du répresseur CI.

3. Vérification de la qualité du NGS

• Validation de la plateforme de séquençage :
  • Courbes standard construites en utilisant le génome de référence λ
  • Profils d'erreur quantifiés :
    Taux d'insertion-suppression
    Fréquences de substitution des bases
• Optimisation du système de préparation de bibliothèque :
  • Évalué l'uniformité de couverture dans les régions extrêmes du GC (λ génome GC=50%)
  • Affinement du protocole de fragmentation informée

4. Génomique évolutive et comparative

• Expansion de la famille de gènes :
  • Analyse de la variation du nombre de copies du module de protéine de queue (par exemple, protéine filamentaire gpH)
  • Révélé les facteurs d'adaptation de la gamme d'hôtes
• Suivi des réarrangements génomiques :
  • Signatures de transfert horizontal de gènes détectées via :
    Analyse des répétitions en tandem
    comparaisons d'architecture de site cos

Résumé des avantages techniques

Étude de cas 1 : Comment Lambda expose l'évolution de son hôte

1. Découverte de sites d'intégration non conventionnels

• Aperçu Mécanistique :
  • Le séquençage de nouvelle génération (NGS) à haute résolution a révélé l'intégration du phage λ à des loci génomiques hôtes non canoniques. Cette avancée démontre une flexibilité d'intégration au-delà des contraintes traditionnelles de recombinaison attB-attP.
• Principales conclusions :
  • Identifié plus de 300 cibles d'intégration génomique hôte uniques.
  • Dépasse significativement le répertoire connu des sites attB
  • Établit une plasticité sans précédent des sites d'intégration.

2. Conséquences phénotypiques et adaptation de l'hôte

• Impacts fonctionnels validés par séquençage :
  L'analyse intégrée de séquençage et de phénotypage démontre que l'intégration non conventionnelle induit :
  • Altérations de la motilité : L'intégration en amont des gènes flagellaires perturbe les voies de régulation de la motilité.
  • Résistance antibiotique renforcée : L'insertion près des gènes de résistance active l'expression ou perturbe les éléments répressifs.
• Signification conceptuelle :
  Cette preuve redéfinit la lysogénie d'un état dormant à un moteur actif de :
  • Remodelage génomique de l'hôte
  • Trajectoires évolutives adaptatives (Tanouchi Y et al., 2017)

Analyse des lysogènes avec intégration dans des sites secondaires (Tanouchi Y et al., 2017)

Étude de cas 2 : Ingénierie génétique de précision utilisant les outils de Lambda

1. Caractérisation du site att

• Fondation Mécanistique :
  Le séquençage précoce du phage λ (y compris la méthodologie de Sanger) a ouvert la voie à un cartographie précise du locus att :
  • Séquence centrale de 15 pb identifiée (GCTTTTTTATACTAA)
  • Architecture des bras de flanquement définie (attP avec bras P/P' ; attB avec bras B/B')
  • Sites de liaison des recombinases résolus (Int, IHF, Xis) incluant la reconnaissance des bras spécifiques à Int.
• Applications d'ingénierie :
  Données de séquence précises activées :
  • Modification de vecteur :
    • insertion d'un fragment contenant attR d'environ 1,6 kb dans le vecteur pKO5.2-C.1
    • Clonage directionnel via attR vérifié par séquence
  • Ingénierie des baculovirus :
    • Insertion de Dest-Bac attR-EGFP au locus UL41
    • La vérification du séquençage a empêché la perturbation de la fonction des gènes viraux.

2. Développement du Système de Recombinase

• Résolution moléculaire :
  Caractérisation du séquençage du génome :
  • gène int (intégrase, génome λ 34,502-35,941 pb)
  • mécanisme de clivage du gène xis (excisionase) via liaison à des répétitions inversées
• Traduction technologique :
  • Développement commercial de Lambda Clonase™ basé sur des recombinases séquencées.
  • Mis en œuvre pour une recombinaison attL-attR à haute efficacité.

3. Validation de la fidélité du système

• Vérification expérimentale :
  La PCR et le séquençage ont confirmé l'intégrité du BAC recombinant :
  • Ligation de la séquence flanquante UL41 correcte
  • Fidélité d'insertion génique (correspondance de bande de 424 pb de DsRED2)
• Importance du contrôle de la qualité
  • Le séquençage établi comme norme de référence pour le succès de recombinaison (vérification de la fusion du site att)
  • Démontré une recombinaison in vitro efficace sans marqueurs de sélection négative (ccdB) (Schmeisser F et al., 2007)

Diagramme schématique de la stratégie de remplacement d'allèle utilisant le vecteur pKO5 (Schmeisser F et al., 2007)

Étude de cas 3 : Concevoir de meilleurs vaccins avec l'affichage Lambda

Ingénierie de Vecteurs de Précision

• Caractérisation structurale : Le séquençage du génome a cartographié la région codante de la protéine de capside λ D (gpD) (NC_001416 : 20 300-21 200 pb), confirmant son extrémité N comme le site de fusion optimal.
• Optimisation de la probabilité de cadre :
  Fournit une base computationnelle pour la probabilité du cadre naturel (théorique 5,6 %, Note Suppl. S1), permettant :
  • Insérer l'optimisation de l'orientation
  • Efficacité de la conception des bibliothèques
• Validation de la capacité vectorielle : Le séquençage a confirmé que le vecteur λ peut accueillir des inserts plus longs (moyenne de 55 aa) par rapport aux limitations du phage M13 (<40 aa).

Conclusion : L'architecture λ permet l'affichage d'épitopes conformationnels complexes (par exemple, le domaine en baril β de FHBP).

2. Cartographie des épitopes guidée par séquençage profond

• Localisation Précise :
  L'analyse NGS de 5 172 séquences en cadre natif a mappé l'épitope FHBP à :
  • Région centrale : S140-K254 (sites de contact d'anticorps 15/23)
  • Sous-domaines critiques :
    › H248-K254 : Motif de liaison essentiel (perte d'activité en cas de mutation)
    › S140-G154 : Domaine de maintien conformationnel
• Analyse du domaine fonctionnel :
  • Limite R247-H248 : Transition du seuil d'affinité de liaison
  • S140-G154 : Rôle structural indirect (augmentation de 23× de KD en cas de mutation)

3. Vérification de l'adaptabilité structurelle

• Différenciation de la performance vectorielle :
  La supériorité de λ sur M13 découle de :
  • flexibilité de fusion N-terminale de gpD (guidée par séquençage)
  • M13 pVIII contraintes stériques (seules les courtes insertions)
• Reconstruction d'épitopes conformationnels :
  λ surpasse M13 en raison de :
  • Affichage de fragments longs (FRC) préservant les interactions à longue portée
  • Maintenance critique de la synergie des domaines (S140-G154 ↔ H248-K254) (Domina M et al., 2016)

Avantages vectoriels comparatifs

Enrichissement des fragments fHbp après sélection par affinité de bibliothèques affichées sur phages et réactivité immunitaire des fragments antigéniques sélectionnés avec l'anticorps monoclonal 12C1 (Domina M et al., 2016)

Étude de cas 4 : Comment Lambda aide à découvrir de nouveaux systèmes viraux

1. Cadre du Système de Recombinaison

• Évaluation structurelle :
  Le séquençage du phage λ (Mizuuchi & Mizuuchi, 1985) a établi les dimensions canonique du site att :
  • attB_λ: 21 pb
  • attP_λ: 140 pb (bras P) + 80 pb (bras P')
    Ceci a servi de références pour caractériser les sites att non canoniques du phage Φ24B :
  • attB_Φ24B: 93 pb (4,4× plus long)
  • attP_Φ24B: 427 pb (3× plus long)
    Conclusion clé : Les séquences att étendues indiquent une divergence mécanistique par rapport aux systèmes λ.
• Référence du domaine de recombinase :
  Domaines de liaison Int dérivés de λ guidant la validation fonctionnelle de Φ24B :
  • Les expériences de suppression ont confirmé Int._Φ24B; fonctionne de manière indépendante de l'IHF
  • Contraste fortement avec Int_λexigence de l'IHF
  • Défis des paradigmes d'intégration centrés sur λ

2. Optimisation du Système Expérimental

• Adaptation de l'essai in vitro :
  Cadre de recombinaison λ transféré (Int, IHF, attP, attB) avec modification clé :
  • attB linéarisé_Φ24B l'efficacité de recombinaison doublée du substrat
  • Innovation critique au-delà des protocoles λ standards
• Système d'expression des protéines :
  Utilisé le plasmide IHF dérivé de λ pEE2003 dans E. coli BL21 (Sambrook et al., 1989) :
  • Purification active d'Int à haut rendement réalisée_Φ24B
  • Activités d'essai comparatif activées

3. Divergence Mécanistique et Applications

• Percées Évolutionnaires :
  λ "standard or" a révélé des adaptations spécifiques à Φ24B :
  • Architecture att asymétrique :
    B-brin : 49 pb contre B'-brin : 20 pb
  • Indépendance de l'IHF :
    Fonctionnel dans les mutants ΔhimA (souche JW1702)
    recombinaison λ strictement dépendante de l'IHF
• Implications biotechnologiques :
  La capacité d'intégration promiscue de Φ24B (>300 sites hôtes) suggère son utilité en tant que :
  • Nouvel outil d'édition génomique
  • Supérieur à λ en polyvalence de site

Validation : Efficacité d'intégration démontrée 3,8 fois supérieure à celle des systèmes λ (Mohaisen MR et al., 2020)

Détermination des sites attP et attB minimaux utilisés par IntΦ24B (Mohaisen MR et al., 2020)

Conclusion

Le séquençage du génome du phage Lambda est devenu une méthodologie fondamentale dans la biologie moléculaire et le génie génétique. Des protocoles de caractérisation systématique associés à des cadres analytiques avancés permettent une délimitation complète de l'architecture génétique du phage λ. Ces capacités facilitent des applications critiques dans divers domaines :

• Développement d'outils moléculaires : Ingénierie de précision des vecteurs de clonage
• Innovation thérapeutique : plateformes de phage display et conception de vaccins
• Solutions biomédicales : Développement d'agents antimicrobiens ciblés

Le perfectionnement technologique continu rehaussera encore la proposition de valeur du séquençage λ, offrant des aperçus structurels à haute résolution et élargissant son utilité en tant que norme de référence génomique polyvalente. Cette progression promet d'accélérer la découverte dans la recherche biologique fondamentale et appliquée.

Pour une approche plus détaillée du séquençage des phages, veuillez vous référer à "Séquençage du génome des phages : Méthodes, défis et applications.

Pour plus d'informations sur ce qu'est le séquençage des phages, voir "Qu'est-ce que le séquençage de phages ? Un guide complet pour les chercheurs.

Pour plus d'informations sur la manière de construire et d'utiliser la base de données de séquences de phages, veuillez vous référer à "Construction et utilisation de bases de données de séquences de génomes de phages.

Références:

1. Tanouchi Y, Covert MW. Combinaison d'une analyse complète de l'intégration du phage Lambda hors site avec un moyen basé sur CRISPR de caractériser la physiologie en aval.. mBio2017 Sep 19;8(5):e01038-17.
2. Schmeisser F, Weir JP. Incorporation d'un système de recombinaison de phage lambda et détection d'EGFP pour simplifier la mutagenèse des chromosomes artificiels bactériens du virus de l'herpès simplex.. BMC Biotechnologie14 mai 2007 ; 7:22.
3. Domina M, Lanza Cariccio V, Benfatto S, Venza M, Venza I, Borgogni E, Castellino F, Midiri A, Galbo R, Romeo L, Biondo C, Masignani V, Teti G, Felici F, Beninati C. Caractérisation fonctionnelle d'un épitope d'anticorps monoclonal utilisant une plateforme d'affichage de phages lambda et de séquençage profond. Sci Rep. 2016 août 17;6:31458.
4. Roy S, Peter S, Dröge P. Production polyvalente de vecteurs d'ADN sans couture dans E. coli en utilisant une intégrase de phage lambda améliorée. PLoS One2022 Sep 23;17(9):e0270173.
5. Mohaisen MR, McCarthy AJ, Adriaenssens EM, Allison HE. Le système de recombinaison spécifique au site du bactériophage Escherichia coli Φ24B. Front Microbiol. 2020 oct 9;11:578056.