Dans le vaste domaine de la science biologique, recherche épigénétique devenir progressivement l'une des frontières essentielles pour explorer les mystères de la vie. Les modifications épigénétiques telles que la méthylation de l'ADN jouent un rôle important dans la régulation de l'expression génique, la différenciation cellulaire et le processus de développement. La détection précise et efficace de ces marqueurs épigénétiques est très importante pour comprendre le mécanisme moléculaire des phénomènes de la vie. Dans ce contexte, la technologie de séquençage par méthylation médiée par des enzymes (EM-seq) est né. Avec son principe technique unique et ses avantages évidents, il a ouvert une nouvelle ère pour la recherche en épigénétique, attiré l'attention de nombreux chercheurs ces dernières années et grandement favorisé le développement de ce domaine.
EM-seq est une technologie de pointe pour la détection précise du niveau de méthylation de l'ADN. Dans le domaine de la recherche en sciences de la vie d'aujourd'hui, il est très important d'explorer le mécanisme de régulation de l'expression génique, et la méthylation de l'ADN, en tant que l'une des modifications épigénétiques clés, a suscité beaucoup d'attention. Avec son principe technique unique et ses avantages évidents, EM-seq devient progressivement un outil puissant pour les chercheurs afin d'analyser en profondeur le mystère de la méthylation.
Cet article présente la technologie de séquençage par méthylation médiée par enzyme, EM-seq, y compris son principe, son flux de travail, ses avantages techniques et ses applications dans la recherche en sciences biologiques, et possède de larges perspectives d'application.
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Le principe de l'EM-seq
Le mécanisme central de la technologie EM-seq repose principalement sur l'effet synergique de la translocation Ten-Eleven (TET) et de l'enzyme APOBEC. Dans l'ensemble du processus de réaction, l'enzyme TET, en tant que "facteur de leadership de l'oxydation", effectue une modification chimique précise sur la 5-méthylcytosine (5mC) grâce à sa forte activité d'oxydation. Plus précisément, l'enzyme TET peut progressivement oxyder la 5mC de manière ordonnée, permettant ainsi sa transformation en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) et 5-aldocytosine (5fC) à travers plusieurs états intermédiaires, et finalement générer de la 5-carboxycytosine (5caC). Chaque étape de la réaction d'oxydation est hautement précise et ordonnée, ce qui constitue une base clé pour le processus de détection ultérieur.
En même temps, l'enzyme APOBEC joue également un rôle indispensable. En tant qu'"exécuteur de désamination" de la cytosine non modifiée, l'enzyme APOBEC possède une grande capacité de reconnaissance spécifique pour la cytosine non modifiée. Une fois la cible reconnue, l'enzyme APOBEC effectue rapidement sa fonction de désamination et convertit la cytosine non modifiée en uracile. Il est à noter que lors du processus d'amplification PCR qui suit, l'uracile sera précisément identifié comme de la thymine, ce qui fournit un indice clé pour distinguer les sites méthylés et non méthylés. Cependant, en raison de la stabilité relative de sa propre structure, la 5mC et ses produits d'oxydation peuvent résister à la désamination de l'enzyme APOBEC et maintenir l'intégrité de leur propre structure.
En raison des différentes caractéristiques d'action de ces deux enzymes, dans les résultats de séquençage final, le site de méthylation d'origine est resté comme cytosine car il n'a pas été affecté par l'enzyme APOBEC. Cependant, le site non méthylé a été transformé en thymine en raison de la désamination par l'enzyme APOBEC et de la conversion de reconnaissance de base lors de l'amplification PCR. Grâce à cette différence remarquable, les chercheurs peuvent distinguer de manière efficace et précise les sites méthylés des sites non méthylés dans les séquences d'ADN, ce qui fournit un soutien technique solide pour explorer davantage le mécanisme de la méthylation de l'ADN dans le processus de vie.
Activité enzymatique des enzymes impliquées dans la détection de 5mC et 5hmC (Vaisvila et al., 2021)
Comment fonctionne l'EM-seq ?
En tant que nouvelle technologie de séquençage, l'EM-seq montre un potentiel remarquable pour analyser avec précision l'état de méthylation de l'ADN. Son principe repose sur la modification habile de l'ADN par une réaction enzymatique, afin de convertir les informations de méthylation en signaux pouvant être reconnus par séquençage à haut débitCe processus abandonne certaines étapes de traitement chimique compliquées qui peuvent entraîner des dommages à l'ADN dans les méthodes traditionnelles, améliore considérablement l'exactitude et la fiabilité de l'expérience, et offre une nouvelle perspective et un nouveau moyen pour les chercheurs de révéler le mécanisme de régulation de la méthylation en biologie du développement, en oncologie et en neurosciences.
Extraction d'ADNSelon la source de l'échantillon, choisissez la méthode d'extraction d'ADN appropriée. Les échantillons de sang peuvent utiliser des kits d'extraction d'ADN commercial pour le sang ; les échantillons de tissu doivent d'abord être lysés, puis l'ADN est extrait par extraction phénol-chloroforme ou adsorption sur colonne en silice. Les échantillons de lignées cellulaires peuvent être digérés avec un lysat cellulaire combiné à de la protéase K pour extraire l'ADN. L'ADN extrait doit être testé pour sa pureté et sa concentration afin de garantir qu'il répond aux exigences expérimentales.
Oxydation de l'enzyme TETUne quantité appropriée d'échantillons d'ADN est mélangée avec l'enzyme TET et le tampon correspondant, puis incubée dans un instrument PCR. En général, les conditions de réaction consistent en une incubation à 37°C pendant 1 à 2 heures, afin que l'enzyme TET puisse oxyder 5mC en 5hmC et d'autres bases modifiées traitables par la suite. Cette étape permet de faire différencier la cytosine méthylée de la cytosine non méthylée en raison de leurs propriétés chimiques pour une différenciation ultérieure.
Traitement au bisulfiteL'échantillon d'ADN oxydé est mélangé avec un réactif de bisulfite et réagi à une température et un temps spécifiques. En général, il est incubé à 50-60°C pendant 12-16 heures pour convertir la cytosine non méthylée en uracile, tandis que la cytosine méthylée reste inchangée. Cette étape est la clé pour distinguer la cytosine méthylée et non méthylée par la technologie EM-seq.
Construction de bibliothèqueLa bibliothèque d'ADN traitée par l'enzyme EM-seq a été amplifiée par réaction PCR pour obtenir un nombre suffisant de molécules de bibliothèque pour le séquençage ultérieur. Dans le processus d'amplification, des amorces ont été conçues en fonction de la séquence de liaison pour garantir l'amplification efficace des fragments de bibliothèque.
Séquençage à haut débitLa bibliothèque construite a été chargée sur la plateforme de séquençage à haut débit et séquencée selon les procédures opérationnelles standard du séquenceur. Pendant le processus de séquençage, l'instrument séquencera chaque fragment d'ADN de la bibliothèque et générera un grand nombre de données de séquençage brutes, qui sont généralement stockées au format FASTQ.
Mécanisme d'action et flux de travail de la méthylation enzymatique Methyl-seq (Vaisvila et al., 2021)
Avantages technologiques de l'EM-seq
Haute précisionLa séquençage traditionnel au bisulfite dégrade beaucoup l'ADN, entraînant une perte d'informations et affectant l'exactitude des résultats. Cependant, l'EM-seq convertit avec précision la cytosine non méthylée en uracile, tout en conservant la cytosine méthylée, ce qui réduit considérablement les erreurs causées par le traitement chimique et peut refléter plus fidèlement l'état de méthylation de l'ADN.
Demande d'échantillon réduitLa technologie EM-seq nécessite très peu d'échantillons initiaux, et seulement une très petite quantité d'échantillons d'ADN est nécessaire pour réaliser l'expérience. Pour ces échantillons cliniques précieux avec une taille d'échantillon limitée, tels que les tissus de biopsie et les cellules embryonnaires en très faible quantité, la technologie EM-seq est sans aucun doute un choix idéal, évitant ainsi le dilemme selon lequel l'analyse de la méthylation ne peut pas être effectuée en raison d'échantillons insuffisants.
Opération simpleEM-seq est plus simple dans le flux opérationnel expérimental, tandis que les étapes de traitement au bisulfite sont compliquées, nécessitant une incubation prolongée et plusieurs purifications. Cependant, le processus de transformation enzymatique de l'EM-seq est relativement simple, et la durée expérimentale est considérablement réduite, ce qui améliore non seulement l'efficacité expérimentale, mais réduit également l'erreur humaine dans le processus expérimental, rendant les résultats expérimentaux plus reproductibles.
Bonne compatibilitéEM-seq peut être combiné avec une variété de plateformes de séquençage en aval, et il peut être parfaitement adapté aux plateformes de séquençage grand public telles qu'Illumina, PacBio et Nanopore, ce qui offre aux chercheurs la possibilité de choisir de manière flexible les méthodes de séquençage en fonction de leurs propres besoins expérimentaux et des conditions d'équipement existantes, et élargit ainsi encore le champ d'application de cette technologie.
La méthode EM-seq présente une uniformité de couverture en GC supérieure (Vaisvila et al., 2021).
Application Pratique de l'EM-seq
En tant que méthode de séquençage innovante, la technologie EM-Seq, avec sa stratégie de traitement enzymatique unique, a franchi les limites de la technologie traditionnelle et a montré un grand potentiel d'application dans de nombreux domaines. Elle devient progressivement un outil puissant pour les chercheurs afin d'explorer les mystères de la vie, de surmonter des problèmes médicaux et de promouvoir le développement des industries connexes telles que l'agriculture.
Champ de la maladie
Recherche sur le cancerLa méthylation de l'ADN joue un rôle clé dans l'apparition et le développement des tumeurs. La technologie EM-seq peut aider les chercheurs à identifier avec précision les sites de méthylation anormaux liés au cancer, fournissant ainsi une base solide pour le diagnostic précoce, l'évaluation du pronostic et le développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour le cancer. Grâce à l'analyse comparative des motifs de méthylation de l'ADN entre les tissus tumoraux et les tissus normaux, il est attendu de trouver des marqueurs de méthylation spécifiques pour le dépistage précoce du cancer.
Recherche en neurosciencesLa fonction normale du système nerveux dépend d'une régulation précise de l'expression génique, et la méthylation de l'ADN joue un rôle important à cet égard. En utilisant la technologie EM-seq, les chercheurs peuvent étudier les anomalies de méthylation dans les maladies du système nerveux (telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, etc.), explorer la pathogénie de ces maladies et ouvrir de nouvelles voies pour trouver des traitements potentiels.
Biologie du développement
Recherche sur le développement embryonnaireDans le processus de développement embryonnaire, la technologie EM-Seq peut être utilisée pour suivre les changements dynamiques de la méthylation de l'ADN des cellules à différents stades de développement et révéler le rôle régulateur de la méthylation dans le processus de détermination du destin cellulaire, de formation des tissus et des organes. En séquençant la méthylation des cellules embryonnaires précoces, nous pouvons comprendre la variation de la méthylation lors d'événements développementaux clés tels que l'implantation embryonnaire et la gastrulation, ce qui fournit des informations importantes pour étudier le mécanisme moléculaire du développement embryonnaire.
Recherche sur la différenciation cellulaireCette technologie peut analyser les changements de méthylation des différents types cellulaires lors de la différenciation et clarifier les effets de la méthylation sur l'expression génique spécifique aux cellules et le maintien de la fonction cellulaire. Prenant la différenciation des cellules souches hématopoïétiques comme exemple, les sites de méthylation spécifiques de différentes cellules progénitrices hématopoïétiques dans le processus de différenciation en divers types de cellules sanguines peuvent être identifiés grâce à la technologie EM-Seq, afin de comprendre en profondeur le mécanisme de régulation de la différenciation des cellules hématopoïétiques.
Recherche en botanique
Recherche sur la croissance et le développement des plantesDans le processus de croissance et de développement des plantes, tel que la germination des graines, la croissance des semis, la floraison et la fructification, la technologie EM-Seq peut être utilisée pour étudier la régulation de la méthylation de l'ADN sur l'expression des gènes et révéler le mécanisme de la méthylation dans la morphogenèse des plantes et le développement des organes.
Étude sur la résistance des plantes au stressLa méthylation de l'ADN changera de manière dynamique lorsque les plantes réagiront à des stress biologiques (tels que les ravageurs et les maladies) et à des stress abiotiques (tels que la sécheresse, la salinité et les basses températures). La technologie EM-Seq peut être utilisée pour analyser ces changements, identifier les sites de méthylation et les gènes liés à la résistance au stress, et fournir un soutien théorique pour l'amélioration des variétés de cultures et l'amélioration de la résistance au stress des cultures.
Distribution des DMRs à travers l'ensemble du génome (Gan et al., 2024)
Défis et solutions de l'EM-seq
En tant que nouvelle technologie potentielle, l'EM-seq a émergé dans de nombreux domaines de recherche, mais elle fait également face à une série de défis épineux dans le processus d'application pratique. Ces défis affectent non seulement l'exactitude et la fiabilité des résultats expérimentaux, mais limitent également l'application efficace de cette technologie dans un plus large éventail de scénarios.
Extraction et fragmentation de l'ADNIl peut y avoir une perte ou une dégradation de l'ADN pendant le processus d'extraction, ce qui affectera les expériences ultérieures. Il est difficile de contrôler l'uniformité de la taille des fragments lors de la fragmentation. Si le fragment est trop long ou trop court, l'efficacité et la précision du séquençage seront réduites. Utilisez un kit d'extraction d'ADN de haute qualité et des méthodes d'extraction optimisées, telles que le choix d'un tampon de lyse adapté au type d'échantillon, et le contrôle strict de paramètres tels que la température et le temps pendant l'extraction. Dans l'étape de fragmentation, des méthodes telles que la digestion enzymatique ou le broyage ultrasonique peuvent être utilisées, et les meilleures conditions de fragmentation peuvent être déterminées par optimisation expérimentale, et des fragments de taille appropriée peuvent être sélectionnés par électrophorèse sur gel d'agarose.
Construction de bibliothèqueL'efficacité faible des connecteurs de connexion entraînera un rendement insuffisant de la bibliothèque. De plus, une déviation peut être introduite lors de l'amplification PCR, ce qui rendra certaines zones sur-amplifiées ou sous-amplifiées, ce qui affectera la précision et la couverture des résultats de séquençage. Optimisez les conditions de réaction de la connexion des connecteurs, telles que l'ajustement du rapport entre le connecteur et le fragment d'ADN, la température et le temps de réaction. Utilisez une ligase de haute qualité pour améliorer l'efficacité de la ligation. Dans le processus d'amplification PCR, un kit d'amplification PCR à faible déviation a été utilisé pour optimiser les conditions de réaction PCR, telles que la température d'annealing et le nombre de cycles. En même temps, le code-barres moléculaire peut être utilisé pour marquer les fragments d'ADN afin de corriger la déviation d'amplification PCR.
Volume de données et ressources informatiquesEM-Seq génère une énorme quantité de données, ce qui nécessite des ressources informatiques élevées, y compris la mémoire, le stockage et la vitesse de calcul. Le processus de traitement et d'analyse des données est complexe, ce qui demande beaucoup de temps et d'énergie. Utilisez un serveur de calcul haute performance ou une plateforme de cloud computing pour répondre aux besoins de traitement et d'analyse des données. Adoptez des technologies de calcul parallèle, de calcul distribué et d'autres pour améliorer l'efficacité des calculs. En même temps, optimisez le processus d'analyse des données et utilisez des algorithmes et des outils logiciels efficaces pour réduire le temps de calcul et la consommation de ressources.
Hétérogénéité de l'échantillonLes échantillons biologiques présentent souvent une hétérogénéité cellulaire, et le niveau de méthylation varie selon les types de cellules ou les états cellulaires, ce qui peut affecter l'analyse précise des motifs de méthylation. Si l'objet de recherche est un type cellulaire spécifique, des techniques de tri cellulaire, telles que la cytométrie en flux et la microdissection par laser, peuvent être utilisées pour séparer d'abord la population cellulaire cible, puis l'analyser par EM-Seq. La technologie EM-Seq à cellule unique peut également être utilisée pour étudier les motifs de méthylation directement au niveau de la cellule unique, afin d'analyser plus efficacement l'hétérogénéité des échantillons.
Bibliothèques EM-seq à faible entrée en ADN (Vaisvila et al., 2021)
Conclusion
En résumé, l'EM-Seq a réalisé de grandes avancées en biomédecine, biologie du développement, neurosciences et recherche sur les plantes grâce à ses avantages uniques. Il fournit un outil précis pour analyser les motifs de méthylation de l'ADN et aide à révéler le mystère des mécanismes de la maladie et du processus de développement. Avec l'optimisation continue de la technologie, ses frontières d'application continueront de s'élargir, ce qui devrait permettre de surmonter davantage de goulets d'étranglement dans la recherche, d'apporter de l'innovation dans tous les domaines des sciences de la vie, de briller plus intensément dans le futur parcours de recherche scientifique et de pousser la cognition humaine sur la nature de la vie à un nouveau sommet.
Références:
- Vaisvila R, Ponnaluri VKC., et al. "Le séquençage méthylique enzymatique détecte la méthylation de l'ADN à une résolution d'une seule base à partir de picogrammes d'ADN." Recherche sur le génome2021 31(7):1280-1289 Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe.
- Gan, J. Huang, M., et al. "Un nouveau profilage de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome révèle un paysage épigénétique distinct, un modèle pronostique et une composition cellulaire du cancer du poumon adénocarcinome à un stade précoce." J Transl Med. 22 428 (2024) Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici, et je serai heureux de vous aider.
- Bahado-Singh RO, Vishweswaraiah S., et al. "Changements de méthylation de l'ADN placentaire et prédiction précoce de l'autisme chez les nouveau-nés à terme." PLoS One. 2021 16(7):e0253340 Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
- Černoša I, Trincado-Alonso F., et al. "Utilisation des données d'ADN libre de cellules (cfDNA) converti enzymatiquement pour l'analyse de fragmentation liée à la variation du nombre de copies permet une détection précoce du cancer colorectal." Int J Mol Sci2024 25(6):3502 Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
- Olkhov-Mitsel E, Bapat B. "Stratégies pour la découverte et la validation de biomarqueurs d'ADN méthylés et hydroxyméthylés." Médecine du cancer2012 1(2) : 237-60 Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou du contenu externe. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
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