Préparation des échantillons pour des résultats de séquençage de haute qualité

Pourquoi la qualité de l'échantillon détermine le succès du séquençage

Dans le monde du séquençage de nouvelle génération (NGS), la qualité de votre échantillon d'entrée est souvent le facteur déterminant le plus significatif de succès — ou d'échec. Même avec le séquenceur le plus avancé et le kit de préparation de bibliothèque, de l'ADN/ARN dégradé, impur ou à faible rendement peut compromettre l'ensemble d'une course.

Raisons clés pour lesquelles la qualité des échantillons est importante

L'efficacité enzymatique dépend de la pureté.

Les étapes de préparation de la bibliothèque—réparation des extrémités, ligature des adaptateurs et amplification par PCR—sont entraînées par des enzymes. Les contaminants tels que le phénol, les sels ou l'éthanol résiduel inhibent ces enzymes.

L'intégrité des fragments affecte le rendement du séquençage.

L'ADN fortement fragmenté ou ébréché entraîne une génération de clusters inefficace ou un mappage de lectures de moindre qualité. Dans les échantillons dérivés de tissus, une intégrité de l'ADN inférieure est associée à des taux de succès significativement plus bas. (Kuwata et al.; données NCI SCRUM-Japon)

3. Les erreurs de quantification se propagent en aval.

Une mesure inexacte de la concentration en ADN entraîne un sous-chargement ou un surchargement du séquenceur. Le surchargement réduit la qualité des clusters ; le sous-chargement gaspille la capacité. Les tests fluorométriques (Qubit, PicoGreen) sont préférés à la spectrophotométrie pour une quantification précise des acides nucléiques.

4. Un faible apport augmente la sensibilité à la contamination.

Dans des échantillons avec peu d'ADN, même de faibles quantités d'ADN exogène (par exemple, provenant de réactifs ou de l'environnement) peuvent fausser les résultats. Des études sur des lectures non mappées ont montré que les échantillons dilués sont particulièrement sensibles aux artefacts de contamination. (Lusk, 2014)

Impact : l'intégrité prédit le succès

Dans une analyse approfondie de tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) (n = 2 573), des échantillons avec haute intégrité de l'ADN (ΔCt < 4,4 selon la métrique qPCR) a donné des taux de succès NGS d'environ 94 %. En revanche, les échantillons de faible intégrité avaient des taux de succès d'environ 5,6 %. (Kuwata et al.)

Ce résultat souligne un point central : aucune "sauvegarde" en aval ne peut pleinement compenser un mauvais matériau de départ. Dès que vous compromettez la qualité de l'échantillon, vous réduisez votre marge d'erreur à chaque étape suivante.

Étapes essentielles dans la préparation d'échantillons pour le séquençage

Pour convertir de manière fiable des matériaux biologiques bruts en acides nucléiques prêts pour le séquençage, les laboratoires doivent suivre un flux de travail discipliné et par étapes. Ci-dessous se trouve une feuille de route affinée, ainsi que des mises en garde et des meilleures pratiques.

2.1 Collecte et Stabilisation des Échantillons

• Choisissez des tubes de collecte ou des conservateurs qui inhibent les nucléases ou la croissance microbienne (par exemple, EDTA pour le sang, RNAlater pour l'ARN).
• Minimisez le nombre de cycles de gel-dégel : chaque cycle dégrade les acides nucléiques de manière incrémentielle.
• Enregistrer les métadonnées d'échantillon (source, temps, historique de température) pour signaler une variabilité anormale ultérieurement.

Pourquoi c'est important : Une mauvaise manipulation à ce stade amplifie les artefacts en aval tels que la fragmentation, la contamination ou la perte.

2.2 Extraction d'ADN / ARN

Cette étape clé isole les acides nucléiques des cellules, des tissus ou des fluides. Le choix de la méthode (basée sur des colonnes, des billes magnétiques, du phénol/chloroforme ou des systèmes automatisés) dépend du type d'échantillon, du débit et des exigences de pureté.

Considérations clés et meilleures pratiques :

• Utilisez des réactifs et des consommables certifiés sans nucléase (pointes, tubes, pointes de pipette filtrantes).
• Après la lyse, assurez-vous de retirer complètement les protéines, les sels, les détergents, le phénol et l'éthanol résiduel. Illumina avertit que les inhibiteurs résiduels (par exemple, le phénol, l'EDTA, les acides humiques) peuvent interférer avec la réparation des extrémités, la ligation ou la PCR.
• Pour certaines matrices difficiles (par exemple, plantes, sols, FFPE), envisagez une étape supplémentaire de nettoyage ou de purification (par exemple, une repurification par colonne centrifuge) pour éliminer les inhibiteurs.
• Choisissez un tampon d'élution compatible avec les étapes en aval (par exemple, 10 mM Tris, pH 7,5–8,5). Illumina suggère d'éviter les tampons riches en EDTA ou acides qui pourraient réduire l'activité enzymatique.
• Pour des flux de travail à haut débit, les plateformes automatisées basées sur des billes magnétiques (par exemple, les systèmes Thermo Fisher KingFisher) offrent une cohérence et une réduction des erreurs de manipulation.

2.3 Quantification et Contrôle de Qualité (CQ)

Après extraction, validez l'intensité, la pureté et l'intégrité de votre acide nucléique avant de continuer.

Vérifications critiques à effectuer :

• Ratios de pureté (A260/280, A260/230) : La spectrophotométrie UV de base révèle une contamination par des protéines, du phénol ou du sel. Plages acceptables : A260/280 ~1,8 pour l'ADN, ~2,0 pour l'ARN ; A260/230 idéalement > 1,8. Illumina recommande ces mesures comme premier dépistage.
• Quantification fluorométrique (Qubit, PicoGreen) : Plus précis pour la quantification des acides nucléiques à double brin. Le guide DNA Prep d'Illumina met explicitement en garde contre le fait de se fier uniquement aux méthodes UV.
• Évaluation de l'intégrité/de la fragmentation :
• – Électrophorèse sur gel ou traces TapeStation / Bioanalyzer (pour l'ADN)
• – Numéro d'intégrité de l'ARN (RIN) ou métriques équivalentes pour l'ARN
• Essais de contrôle qualité optionnels :
• – Petite amplification PCR "test" pour détecter les inhibiteurs
• – Contrôle de spike-in ou standard synthétique pour surveiller le biais de rendement
• Documentez tous les indicateurs de contrôle qualité dans votre carnet de laboratoire ou votre système LIMS pour aider à diagnostiquer les échecs ultérieurs.

2.4 Stockage et transport des échantillons d'acides nucléiques

Préserver l'intégrité de l'échantillon après l'extraction est aussi important que l'extraction elle-même.

Directives pour le stockage et l'expédition :

• À court terme : Conservez les aliquotes à 4 °C si le traitement a lieu dans les heures qui suivent ; sinon, à –20 °C.
• À long terme : Conserver à –80 °C (surtout pour l'ARN).
• Tampon : Utilisez un tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) à pH 7,5 pour l'ADN ; évitez les cations divalents ou les tampons qui favorisent la dégradation.
• Évitez le gel-dégel répété : Divisez les échantillons en volumes plus petits.
• Chaîne du froid pendant l'expédition : Utilisez de la glace carbonique ou des boîtes de transport validées pour maintenir la température. Enregistrez la température avec des enregistreurs de données.
• Étiquetage et métadonnées : Inclure les identifiants, la concentration, les métriques de contrôle qualité et l'historique de manipulation.

Comment améliorer la qualité de l'ADN pour le séquençage NGS

Même un protocole d'extraction bien conçu peut produire de l'ADN suboptimal si des détails mineurs sont négligés. Voici des tactiques affinées et des meilleures pratiques pour amener la qualité de votre échantillon près des niveaux idéaux pour le séquençage.

3.1 Utiliser des matières premières à haute intégrité

• Chaque fois que possible, commencez avec des tissus fraîchement collectés ou congelés rapidement. Les cycles répétés de congélation-décongélation dégradent l'ADN au fil du temps.
• Pour des échantillons difficiles (par exemple, FFPE, anciens échantillons archivés), envisagez de cibler des amplicons plus courts ou d'utiliser la capture hybride au lieu du séquençage du génome entier.
• Dans les études comparatives, les méthodes d'extraction présentent une variation de ≥10 % dans le rendement et la taille des fragments, en fonction du type de cellule et du protocole de lyse (ScienceDirect, article "Évaluation de la qualité de l'ADN").

3.2 Optimiser les conditions de lyse et de liaison

• Adapter la composition du tampon (par exemple, en utilisant des détergents suffisants, de la protéinase K et des concentrations optimales en sel) pour décomposer complètement les parois cellulaires, les membranes et les complexes protéiques.
• Pour les échantillons contenant une forte teneur en polysaccharides ou en composés phénoliques (par exemple, les plantes, le sol), incluez des étapes de nettoyage supplémentaires ou des additifs de tampon de liaison (par exemple, PVPP, CTAB ou colonnes d'élimination des inhibiteurs).
• Utilisez un mélange doux (par exemple, une rotation lente) plutôt que le vortexage pour éviter le cisaillement mécanique de l'ADN génomique.
• Maintenez les temps d'incubation juste assez longs pour une lyse complète ; une surincubation dans des conditions sévères peut endommager les extrémités de l'ADN.

3.3 Éviter les inhibiteurs et les contaminants résiduels

• Après les étapes de liaison et de lavage, retirez soigneusement l'éthanol résiduel—ne pas trop sécher le culot, car cela peut rendre la re-dissolution inefficace.
• Utilisez un lavage supplémentaire (par exemple, 70 % d'éthanol) ou une étape de "tampon de lavage + 80 % d'éthanol" lors du travail avec des contaminants collants.
• Inclure une étape de purification avec une RNAse ou une DNase (selon la cible), si nécessaire, pour éliminer les espèces d'acides nucléiques indésirables.
• Utilisez une étape de centrifugation finale ou de vide pour éliminer les sels ou réactifs résiduels (par exemple, guanidine, EDTA) qui pourraient inhiber les enzymes en aval.

3.4 Stratégies d'élution douces

• Chauffez le tampon d'élution (par exemple, à 37 °C) avant de l'appliquer sur la colonne ou les billes ; laissez-le incuber sur la matrice pendant 2 à 3 minutes avant de centrifuger.
• Éluez dans un tampon à faible concentration en sel (par exemple, 10 mM Tris, pH 7,5) ou dans de l'eau sans nucléase (si acceptable) plutôt que dans des tampons contenant trop d'EDTA.
• Utilisez des volumes d'élution qui sont juste suffisants pour la concentration sans sacrifier le rendement. Pour certains utilisateurs, deux élutions en petits volumes consécutives donnent une meilleure concentration et récupération.

3.5 Utiliser l'automatisation et des consommables propres

• Les plateformes automatisées (par exemple, les robots à billes magnétiques) réduisent les erreurs humaines et la variation entre les lots.
• Utilisez toujours des pipettes à filtre, des consommables stériles et des zones dédiées avant et après la PCR pour garantir le plus haut niveau de sécurité et de précision.
• Maintenez les stocks de réactifs correctement (évitez les décongélations répétées) et auditez-les régulièrement pour garantir des performances optimales.

3.6 Polissage post-extraction (optionnel mais crucial pour les échantillons difficiles)

• Pour les extraits de faible pureté, appliquez un kit de purification (par exemple, des billes SPRI, des colonnes de silice) pour éliminer davantage les inhibiteurs.
• Si nécessaire, effectuez une sélection de taille pour éliminer les fragments très courts (par exemple, <200 pb) qui pourraient dominer lors de la préparation de la bibliothèque.
• Utilisez des enzymes de réparation de l'ADN ou des enzymes de polissage des extrémités pour réparer les coupures, mais uniquement lorsque l'ADN de départ est raisonnablement intact.

Sources de contamination courants et comment les prévenir

Même lorsque chaque étape moléculaire est techniquement correcte, la contamination peut annuler votre séquençage. Ici, nous décomposons les voies de contamination fréquentes et les stratégies de prévention pratiques, présentées sous la forme d'une liste de contrôle pour le laboratoire.

4.1 Types de contamination dans les flux de travail de séquençage

4.2 Stratégies de prévention : Une approche par checklist

Voici une liste de contrôle pratique que vous pouvez adopter dans votre laboratoire pour réduire le risque de contamination :

• ☐ Séparer complètement les zones pré-PCR (ou pré-bibliothèque) et post-PCR/bibliothèque.Ne ramenez jamais de matériaux en amont.
• ☐ Utiliser équipements et consommables dédiés dans chaque zone (pipettes, tubes, pointes de filtre).
• ☐ Réactifs aliquotes (par exemple, amorces, tampons) dans des flacons à usage unique pour minimiser les ouvertures répétées.
• ☐ Utilisez des pointes de filtre résistantes aux aérosols. ou pipettes à déplacement positif.
• ☐ Décontaminer les surfaces et les outils régulièrement : eau de Javel (10–15 %), irradiation UV et réactifs de décontamination de l'ADN.
• ☐ Inclure des témoins négatifs et des blancs d'extraction. dans chaque exécution de flux de travail.
• ☐ Suivre les numéros de lot des kits de réactifs. et effectuer des vérifications de fond ou des "tests à blanc" lors du changement de lots. (La variabilité des kits de réactifs ("kitome") a montré qu'elle diffère selon les lots)
• ☐ Restreindre les déplacements du personnel — changez de gants, de blouses de laboratoire ou mettez un équipement de protection en traversant les zones.
• ☐ Minimiser les cycles de PCR, en particulier pour les régions cibles fortement amplifiées, afin de réduire la sensibilité au carryover
• ☐ Adoption de la prévention des résidus d'ADN par dUTP + uracile-ADN glycosylase (UNG) dans la bibliothèque ou la préparation de PCR pour dégrader les contaminants d'amplicon.

4.3 Méthode Exemple : UNG + dUTP pour le Contrôle de Carry-Over

Pour limiter la contamination par amplification, certains laboratoires incorporent de l'dUTP dans les produits de PCR et utilisent de l'uracile-DNA glycosylase (UNG) avant les réactions suivantes. L'UNG clive les bases d'uracile (dans les amplicons précédents), rendant l'ADN contaminant non amplifiable tout en préservant les modèles d'ADN natifs sans uracile.

Un protocole publié a adapté cela pour la préparation de bibliothèque PCR en deux étapes. Ils ont montré une réduction significative de la contamination par carry-over tout en maintenant le rendement et la diversité de la bibliothèque.

4.4 Remarque : Contamination par kit dans les flux de travail métagénomiques

Une étude récente a examiné plusieurs marques de réactifs d'extraction d'ADN et a trouvé des signatures distinctes de "microbiote de fond" uniques à chaque lot de kit. Certains réactifs contenaient de l'ADN microbien qui pouvait biaiser le profilage métagénomique s'il n'était pas contrôlé.

Cela souligne l'importance d'utiliser des blancs de réactifs comme contrôles internes et d'interpréter les lectures à faible abondance avec prudence.

Liste de contrôle pratique pour le contrôle de la qualité des échantillons

Voici une liste de contrôle robuste et adaptée aux laboratoires que vous pouvez adopter pour valider la qualité de votre ADN/ARN avant d'investir dans la préparation de bibliothèques. Utilisez cela comme un gardien pour détecter les matériaux d'entrée de mauvaise qualité dès le début.

⚙️Exemple de liste de contrôle QC : Indicateurs clés et seuils

*Les seuils peuvent varier en fonction de votre protocole de bibliothèque et des montants d'entrée ; consultez toujours la documentation de votre kit.

Notes de mise en œuvre et meilleures pratiques

• Documentez chaque indicateur de contrôle qualité. dans votre LIMS ou votre carnet de laboratoire. Capturez les traces brutes (par exemple, gel, électrophorégramme) en tant que pièces jointes de fichier.
• Appliquez les portes tôt. Si un échantillon échoue aux contrôles A260/230 ou fluorométriques, ne perdez pas de réactifs en essayant de préparer la bibliothèque.
• Utiliser le contrôle qualité de réplication pour des échantillons critiques. En particulier pour des matériaux d'entrée précieux, effectuez des duplicatas des essais de quantification ou d'intégrité.
• Réalisez des blancs de réactifs en parallèle. Traitez les contrôles "sans ADN/ARN" pour détecter la contamination du kit ou les interférences de fond.
• Signaler les échantillons à la limite. Attribuez-les à une catégorie "surveillance" — procédez avec prudence ou des étapes de nettoyage supplémentaires.
• QC à nouveau après les étapes de nettoyage ou de polissage. Si vous effectuez des nettoyages supplémentaires de billes ou une sélection de taille, répétez la quantification et les contrôles d'intégrité.

Lien vers le contenu associé

Pour en savoir plus sur la validation de bibliothèque post-QC et les métriques, consultez notre article "Contrôle de qualité avant le séquençage : garantir l'intégrité des données", où nous plongeons plus profondément dans des métriques telles que Q30, la densité des clusters et la qualité de lecture."

De plus, cet article est lié à "Stratégies de préparation de bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération", qui décrit comment les portes de contrôle qualité s'intègrent dans des flux de travail de bibliothèque efficaces."

Étude de cas : Comment une préparation d'échantillons rigoureuse a sauvé le succès du NGS dans un flux de travail de type CRO.

Dans une récente analyse institutionnelle du séquençage des tumeurs rares, environ 14,7 % Des séquençages ont échoué en raison d'une quantité ou d'une qualité de matériel d'entrée insuffisante. (Itkin et al., 2025. DOI : https://doi.org/10.3892/mi.2025.226) Parmi les huit tests échoués qui ont été retestés, sept ont réussi après réextraction ou ajustements de préparation.

Leçons pour les environnements CRO

À partir de cette expérience, les équipes de laboratoire et les chefs de projet peuvent adopter ces stratégies :

En pratique, appliquer ces leçons dans l'environnement de vos CRO pourrait réduire les taux d'échec de ~10 % à moins de 3 %.

Figure 1 - Diagramme de flux du protocole d'étude. NGS, séquençage de nouvelle génération.

Prochaines étapes pour améliorer votre flux de travail de séquençage

Pour approfondir votre compréhension et intégrer sans effort la préparation d'échantillons dans votre pipeline de séquençage plus large, voici trois ressources très pertinentes :

Comment concevoir des amorces pour le séquençage de l'ADN : un guide pratique — Découvrez comment la conception des amorces influence le succès en aval et aide à éviter le biais d'amplification.

Comment séquencer un gène : Workflow expérimental étape par étape — Explorez le protocole complet de bout en bout, en plaçant la préparation des échantillons dans son contexte plus large.

Stratégies de préparation de bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération — Plongez dans les méthodes de ligation d'adaptateurs, de sélection de taille et d'autres détails de construction de bibliothèques.

En reliant vos choix de QC et de préparation à ces sujets adjacents, vous maintenez un hub de contenu cohérent qui guide les lecteurs à travers chaque étape du séquençage.

Conclusion finale

Des résultats de séquençage de haute qualité commencent bien avant le séquenceur—au niveau de la préparation des échantillons. Lorsque vous mettez en œuvre des contrôles qualité stricts, un contrôle de la contamination et des stratégies de sauvegarde, vous augmentez considérablement votre fenêtre de succès.

Si vous le souhaitez :

• Validez votre processus de préparation existant.
• Développez des seuils de contrôle qualité personnalisés pour votre laboratoire.
• Sécuriser un projet de séquençage pilote avec des performances garanties.

…notre équipe d'experts en séquençage est prête à collaborer. Contactez-nous aujourd'hui. pour examiner votre protocole ou demander une consultation.

FAQs

Q : Qu'est-ce qui fait échouer le séquençage ?

Les échecs de séquençage proviennent souvent d'une mauvaise qualité d'échantillon : une faible intégrité de l'ADN, des contaminants résiduels (phénol, éthanol, sels) ou des inhibiteurs issus du processus d'extraction peuvent bloquer des étapes enzymatiques comme la ligature ou la PCR. Parfois, la contamination croisée ou le transfert de réactifs peuvent annuler un bon échantillon d'entrée et entraîner un échec complet.

Q : Comment puis-je améliorer la qualité de l'ADN pour le séquençage NGS ?

Vous pouvez améliorer la qualité de l'ADN en utilisant du matériel de départ frais ou correctement stocké, en optimisant les conditions de lyse pour éviter la dégradation, en effectuant des étapes de nettoyage supplémentaires pour éliminer les inhibiteurs, en éluant doucement dans un tampon à faible teneur en sel et en utilisant des systèmes d'extraction automatisés avec des performances constantes.

Q : Quels sont les indicateurs clés que je devrais vérifier avant de procéder à la préparation de la bibliothèque ?

Vous devez vérifier les rapports de pureté (A260/280 et A260/230), la concentration précise par fluorescence (Qubit ou PicoGreen) et l'intégrité (gel, TapeStation ou Bioanalyzer). Un contrôle négatif de blanc aide à détecter la contamination de fond avant de s'engager dans la préparation de la bibliothèque.

Q : Comment puis-je prévenir la contamination dans mon flux de travail de séquençage ?

Prévenir la contamination par la séparation physique des zones pré- et post-PCR, l'utilisation de pointes filtrantes et d'instruments dédiés, la décontamination (eau de Javel, UV), les témoins de réactifs, l'aliquotage des réactifs, la restriction des déplacements du personnel, et éventuellement l'utilisation de systèmes dUTP/UNG pour éliminer les amplicons résiduels.

Q : Puis-je sauver des échantillons d'ADN de faible qualité ?

Parfois. Si l'ADN est modérément impur ou légèrement dégradé, l'application d'étapes de polissage (par exemple, nettoyage avec des billes SPRI, sélection de taille, réparation des coupures) peut le faire passer au-dessus des seuils de préparation de bibliothèque. Cependant, l'ADN gravement fragmenté ou fortement contaminé ne peut souvent pas être entièrement récupéré sans ré-extraction.

Q : Pourquoi la quantification par UV (Nanodrop) est-elle souvent peu fiable ?

La spectrophotométrie UV mesure tous les acides nucléiques et les substances absorbantes, y compris les nucléotides libres, les amorces et les contaminants, ce qui conduit à une surestimation. Les méthodes fluorométriques (par exemple, Qubit) se lient spécifiquement à l'ADN double brin et sont plus précises pour la préparation de bibliothèques.

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