Comment séquencer un gène : Workflow expérimental étape par étape

Introduction — Que signifie séquencer un gène ?

Séquençage génétique est le processus de détermination de l'ordre exact des nucléotides—adénine (A), thymine (T), cytosine (C) et guanine (G)—au sein d'une molécule d'ADN. En termes pratiques, cela permet aux chercheurs de connaître le "plan" génétique précis qui définit la structure et la fonction d'un gène. Comprendre cette séquence permet aux scientifiques d'explorer comment les gènes fonctionnent, comment ils varient entre les organismes et comment les mutations impactent les processus biologiques.

Dans les laboratoires de recherche académique et contractuels, le séquençage des gènes est l'un des flux de travail les plus courants utilisés pour vérifier les résultats de clonage, identifier les mutations et caractériser les gènes nouvellement découverts. Bien que les technologies de séquençage aient évolué de manière spectaculaire - du séquençage Sanger aux plateformes modernes de séquençage de nouvelle génération à haut débit - la logique expérimentale de base reste la même : extraire, amplifier, purifier et lire la séquence.

Suivre un flux de travail systématique est essentiel pour obtenir des résultats fiables et interprétables. Un ADN de mauvaise qualité, des amorces suboptimales ou une purification inadéquate peuvent entraîner des chromatogrammes illisibles ou des données bruyantes, faisant perdre du temps et des réactifs. En comprenant chaque étape expérimentale dans la détermination de séquence, le personnel de laboratoire peut concevoir de meilleures expériences et résoudre les problèmes courants avant l'analyse des données.

Comme ce guide l'explique, le flux de travail expérimental étape par étape pour le séquençage d'un gène, il se concentrera sur les aspects pratiques qui affectent directement la qualité des données—en particulier pour les chercheurs académiques et les techniciens de CRO qui effectuent régulièrement du séquençage au niveau des gènes. Pour des conseils sur la conception des amorces, vous pouvez également vous référer à notre article compagnon, Comment concevoir des amorces pour le séquençage de l'ADN : un guide pratique.

Étape 1 : Extraire de l'ADN de haute qualité de vos échantillons

Le séquençage génétique réussi commence par l'extraction d'ADN intact, pur et en quantité suffisante. Une mauvaise qualité de l'ADN est une cause fréquente d'échecs de PCR ou de résultats de séquençage illisibles. Voici des pratiques clés, des mises en garde et des conseils pour une extraction fiable dans les laboratoires de recherche et les environnements CRO.

2.1. Collecte, stockage et prétraitement des échantillons

• Choisissez des échantillons frais ou bien préservés. Les tissus dégradés ou les cycles de congélation-dégel prolongés réduisent l'intégrité de l'ADN.
• Pour les cellules, les tissus ou les cultures microbiennes, collectez à un stade de croissance optimal (par exemple, ~80 % de confluence pour les cellules adhérentes).
• Utilisez des consommables sans ADN et sans nucléase (pointes, tubes, réactifs) pour éviter la contamination.
• Congeler rapidement ou stocker à –80 °C pour un stockage à long terme ; le stockage à court terme peut se faire à 4 °C dans un tampon.
• Si les tissus sont rigides ou inflexibles (par exemple, tissu végétal, tissu fibrotique), pré-homogénéisez (broyage, battement de billes) pour faciliter une lyse efficace.
• L'homogénéisation des tissus est essentielle pour maximiser le rendement.

2.2. Lyse cellulaire et inactivation de la nucléase

• Utilisez un tampon de lyse contenant un détergent (par exemple, SDS, Triton X-100) ainsi qu'un sel chaotropique (par exemple, l'isothiocyanate de guanidine) pour perturber les membranes et dénaturer les protéines.
• Ajoutez de la protéinase K (ou une autre protéase) pendant la lyse pour digérer les protéines (y compris les histones et les nucléases).
• Incubez à une température optimale (par exemple, 55–65 °C) avec un mélange occasionnel jusqu'à ce que la digestion soit complète.
• Inclure de l'EDTA ou d'autres chélateurs pour séquestrer les ions divalents et inhiber les DNases.

2.3. Liaison de l'ADN / Séparation des impuretés

Après la lyse, vous devez séparer l'ADN des protéines, des lipides et d'autres débris cellulaires. Les stratégies courantes incluent :

• Colonne de silice / liaison de membrane (colonnes à centrifuger) : L'ADN se lie à la silice dans des conditions de forte salinité, puis est lavé et éluté.
• Capture par billes magnétiques : l'ADN se lie aux billes ; des aimants séparent les billes de la solution, permettant des étapes de lavage.
• Extraction organique (phénol : chloroforme) : Méthode classique, mais implique des solvants dangereux et est plus laborieuse.
• Précipitation (éthanol / isopropanol + sels) : Utile pour concentrer l'ADN, mais moins sélective et plus risquée pour la co-précipitation de contaminants.

Lors du choix d'une méthode, prenez en compte les compromis : les colonnes et les billes fournissent de l'ADN plus pur et plus rapidement ; l'extraction organique peut donner plus d'ADN à partir d'échantillons difficiles si elle est manipulée avec soin.

2.4. Lavage et Élution

• Les étapes de lavage (par exemple, éthanol à 70 %) éliminent les sels, les détergents et les impuretés résiduelles.
• Il est essentiel de sécher ou d'essorer complètement le culot de colonne/bille pour éliminer l'éthanol résiduel (qui peut inhiber les enzymes en aval).
• Éluez l'ADN dans un tampon à faible concentration en sel (par exemple, TE, Tris) ou dans de l'eau sans nucléase. Préchauffer le tampon d'élution à environ 50 °C peut améliorer le rendement.
• Utilisez un volume d'élution minimal compatible avec les étapes en aval pour augmenter la concentration effective.

2.5. Contrôle de la qualité : Rendement, Pureté et Intégrité

Avant de procéder à la PCR et au séquençage, évaluez la qualité de l'ADN en utilisant :

• Spectrophotométrie (A260/A280, A260/A230) : Plages de pureté préférées ~1,8 (sans protéines) et >1,8 pour 260/230 (contaminants salins).
• Quantification fluorométrique (par exemple, Qubit) pour obtenir une concentration précise d'ADN double brin.
• Électrophorèse sur gel d'agarose : Visualiser la bande de haut poids moléculaire ; détecter la dégradation ou le flou.
• Optionnel : électrophorèse capillaire ou TapeStation / Bioanalyzer pour une taille/intégrité plus précise.

Si l'ADN montre une dégradation, un faible rendement ou une pureté médiocre, revoyez les conditions de lyse, les étapes de lavage ou la manipulation des échantillons.

Étape 2 : Amplifier le gène cible par PCR

Une fois que vous avez de l'ADN de haute qualité, l'étape suivante cruciale consiste à amplifier sélectivement votre gène d'intérêt par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Une PCR bien conçue et optimisée est essentielle pour obtenir des lectures de séquençage propres par la suite.

3.1. Pourquoi la PCR avant le séquençage ?

• La PCR augmente le nombre de copies d'ADN pour la région cible afin d'améliorer la force du signal lors du séquençage.
• Cela enrichit le fragment correct au milieu d'un contexte génomique complexe.
• Un échantillon trop complexe (par exemple, l'ADN génomique entier) sans enrichissement conduit souvent à des lectures faibles ou ambiguës.

Les directives de séquençage réglementaires soulignent qu'une PCR robuste et spécifique est un déterminant significatif du succès du séquençage.

3.2. Composants de la réaction et concentrations

Un mélange PCR typique comprend :

3.3. Stratégie de cyclage thermique

Un programme PCR standard suit souvent :

• Dénaturation initiale (~95 °C, 2 min) — dénaturer complètement l'ADN modèle.
• Étape de dénaturation à chaque cycle (95 °C, 15–30 s)
• Étape de recuit (Tm – ~5 °C, ~15–30 s) — les amorces se lient à la cible.
• Étape d'extension (généralement 68–72 °C, ~1 min par kb)
• Extension finale (68–72 °C, 5–10 min) — garantit une extension complète.
• Conserver à 4 °C.

Si votre cible a un contenu élevé en GC ou des structures secondaires, envisagez le PCR à température décroissante : commencez par l'hybridation à une température plus élevée et abaissez-la progressivement à chaque cycle pour améliorer la spécificité.

3.4. Choix de la polymérase et préoccupations concernant la fidélité

• Utilisez une polymérase à haute fidélité (avec activité de correction) pour minimiser les taux d'erreur dans votre amplicon, surtout si le séquençage en aval est sensible aux incompatibilités.
• Certain polymérases sont conçues pour amplifier des régions riches en AT ou en GC. Par exemple, Phusion Plus a montré qu'il pouvait amplifier des modèles extrêmement riches en AT (jusqu'à 90 % AT) avec une optimisation appropriée.
• Lors de l'amplification de modèles riches en GC, envisagez d'utiliser des mélanges maîtres avec des agents améliorateurs de GC, ou d'ajouter du DMSO, de la bétaïne ou d'autres additifs pour déstabiliser les structures secondaires.

3.5. Stratégies avancées de PCR et dépannage

• PCR en nested : utile lorsque la spécificité est faible. Effectuez un premier tour avec des amorces externes, puis un deuxième tour avec des amorces internes (nested) pour réduire l'amplification non ciblée.
• PCR à démarrage à chaud : prévient la liaison ou l'extension non spécifique des amorces à température ambiante en retardant l'activité de la polymérase jusqu'au premier cycle de dénaturation. Cela augmente la spécificité.

Conseils de dépannage :

• Si vous voyez plusieurs bandes ou une traînée, augmentez la température d'annealing ou réduisez le nombre de cycles.
• Si aucune amplification : vérifiez la conception des amorces, la concentration du modèle ou le niveau de magnésium.
• Pour des bandes faibles : augmentez le temps d'extension ou ajustez la concentration de la polymérase.

Étape 3 : Purifier le produit PCR pour le séquençage en aval

Après amplification, votre produit PCR contient encore des amorces résiduelles, des nucléotides libres (dNTPs), de l'ADN polymérase, des sels et des composants de tampon. Ces contaminants peuvent gravement dégrader la performance du séquençage, en introduisant du bruit, en raccourcissant la longueur des lectures ou en provoquant des échecs de lecture. Ainsi, l'étape de purification est essentielle.

Ci-dessous, je décris les principales stratégies de purification, leurs avantages/inconvénients, et des conseils pratiques pour obtenir de l'ADN prêt pour le séquençage.

4.1. Pourquoi la purification est-elle importante ?

• Les amorces non incorporées peuvent générer des débuts de séquençage spuriques ou des pics de fond.
• Des dNTPs en excès perturbent le rapport entre les dNTP et les nucléotides terminators marqués (dans le séquençage de Sanger), ce qui réduit la clarté du signal.
• Des polymères résiduels ou des sels de tampon peuvent inhiber les enzymes de séquençage ou réduire la qualité des lectures.
• Lorsque seule une bande de produit PCR propre est présente, un nettoyage plus simple est souvent suffisant ; si plusieurs bandes apparaissent, la purification par gel est plus sûre.

4.2. Méthodes de purification courantes

Voici des stratégies de nettoyage couramment utilisées, avec des notes comparatives.

4.3. Conseils pratiques et meilleures pratiques

• Choisissez la méthode en fonction de la spécificité de la PCR : Si votre PCR produit une seule bande nette, le nettoyage enzymatique ou par colonne est le plus rapide et le plus sûr. Si plusieurs bandes apparaissent, utilisez l'extraction par gel pour isoler le bon fragment.
• Volume d'élution de contrôle vs concentration : Utilisez un volume d'élution minimal (par exemple, 20-30 µL) pour maintenir une concentration suffisante pour le séquençage.
• Séchez bien les billes sèches ou les colonnes à centrifuger : L'éthanol résiduel des tampons de lavage peut inhiber les enzymes de séquençage (en particulier les polymérases).
• Préchauffez le tampon d'élution (~50 °C) pour augmenter la récupération de l'ADN.
• Validez le produit purifié sur gel ou par spectrophotométrie pour garantir l'absence de dimères d'amorces ou de traînées.
• Pour les protocoles de nettoyage enzymatique :

    Un protocole typique ExoI + SAP de Thermo Fisher utilise ~5 µL de produit PCR + 0,5 µL d'ExoI + 1 µL de SAP, incuber à 37 °C pendant 15 minutes, puis à 85 °C pendant 15 minutes pour inactiver.

• Optimiser le rapport de billes (pour les méthodes SPRI) : Ajuster le rapport billes : volume de réaction pour exclure les fragments plus petits (par exemple, les dimères d'amorces) tout en conservant l'amplicon de pleine longueur.
• Minimisez l'exposition aux UV : lors de l'extraction de gel, utilisez une intensité UV minimale ou une transillumination par lumière bleue pour réduire les dommages à l'ADN.

Étape 4 : Choisissez une méthode de séquençage génétique

Une fois que votre produit PCR est propre, la prochaine décision est laquelle technologie de séquençage est approprié pour votre objectif. Ce choix impacte directement le coût, le débit, la longueur de lecture, la précision et les flux de travail en aval. Ci-dessous se trouve une comparaison des principales options et des conseils pour choisir la bonne méthode pour le séquençage au niveau des gènes.

5.1. Séquençage Sanger (Méthode capillaire / Didéoxy)

Comment ça fonctionne (brièvement) :

• La chimie classique des dideoxynucléotides terminators utilise des ddNTPs marqués par fluorescence pour terminer l'extension de la chaîne d'ADN à chaque position de base.
• Des fragments différant par des nucléotides uniques sont séparés par électrophorèse capillaire ; des détecteurs enregistrent la fluorescence pour déduire l'ordre des bases.
• Généralement, cela donne des longueurs de lecture allant jusqu'à ~800–1 000 pb (zone utilisable ~500–800 pb).

Forces :

• Précision de base très élevée (généralement > 99,9 %)
• Sortie de données directe (chromatogrammes avec des exigences computationnelles minimales)
• Idéal pour vérifier des gènes uniques ou un petit nombre de cibles.
• Surcharge d'infrastructure minimale par rapport aux systèmes à haut débit

Limitations :

• Faible débit (un fragment par réaction) — pas rentable lors de l'échelle à de nombreux gènes
• Les limites de plafond de longueur de lecture sont utilisées pour des amplicons plus longs ou des régions complexes.
• La sensibilité aux variants de faible abondance est modeste (la détection des allèles rares est difficile).

Scénarios d'utilisation optimaux :

• Validation des appels de variants à partir de données à haut débit
• Confirmation des inserts de plasmides ou des constructions de gènes clonés
• Projets avec peu d'amplicons où le coût de mise en place doit rester bas.

5.2. Séquençage de nouvelle génération (NGS / Séquençage Massivement Parallèle)

Aperçu et principe :

Les méthodes NGS séquencent de nombreux fragments d'ADN dans massivement parallèle mode, permettant des lectures simultanées sur des milliers ou des millions d'amplicons.

Les types courants de NGS incluent le séquençage par synthèse (Illumina), le semi-conducteur ionique (Ion Torrent) et la molécule unique. plateformes de longs articles (PacBio, Oxford Nanopore).

Avantages :

• Haut débit : de nombreux gènes ou échantillons peuvent être multiplexés en une seule course.
• Couverture approfondie : prend en charge la détection sensible des variants à basse fréquence
• Échelle flexible : adaptée au séquençage de panneaux, d'amplicons ou même de petits génomes.
• Coût par base réduit lors de l'échelle.

Défis et compromis :

• Une courte longueur de lecture (pour de nombreuses plateformes) peut compliquer le mappage dans des régions répétitives ou structurellement complexes.
• Nécessite une préparation de bibliothèque (non couverte ici)
• Les coûts de traitement des données et de bioinformatique sont plus élevés.
• Les erreurs (en particulier les erreurs systématiques) doivent être atténuées par le contrôle qualité et la profondeur.

Exemple de cas notable :

Dans une étude sur le virus de la fièvre aphteuse, le séquençage de nouvelle génération a révélé des variants à faible fréquence présents à <1% dans la population virale—des variants que le séquençage Sanger aurait manqués.

5.3. Séquençage à long-reads / à molécule unique

Bien que souvent considérées dans des contextes à l'échelle du génome, les plateformes de séquençage à longues lectures peuvent parfois être appliquées au séquençage de gènes, en particulier lorsque des variations structurelles ou des domaines répétitifs sont impliqués.

• Séquençage PacBio / SMRT: produit des lectures de plusieurs kilobases avec une précision de consensus relativement élevée après correction des erreurs.
• Oxford Nanopore: peut générer des lectures très longues, est flexible et prend en charge le basecalling en temps réel

Ces méthodes aident à résoudre des régions difficiles (par exemple, les répétitions, les domaines riches en GC) ou le phasage des variants au sein d'une même molécule.

Une étude sur l'assemblage de génomes microbiens a révélé que les lectures longues à molécule unique réduisaient la complexité de l'assemblage et fermaient des lacunes que les courtes lectures ne pouvaient pas résoudre.

5.4. Matrice de Décision : Quelle Méthode Convient à Votre Projet ?

Recommandations pratiques :

• Si vous n'avez qu'un ou quelques gènes à séquencer, la méthode de Sanger est fiable et rentable.
• Pour les projets avec plusieurs gènes, des panels de gènes ou des échantillons multiplexés, le séquençage de nouvelle génération (NGS) offre une grande évolutivité.
• Si votre gène contient des motifs hautement répétitifs ou si vous souhaitez capturer des variations structurelles à longue portée, envisagez le séquençage à longues lectures.
• Vous pouvez également adopter une approche hybride : par exemple, séquencer largement avec le NGS et valider des variants spécifiques avec Sanger.

Étape 5 : Analyser et valider les données de séquençage

Après avoir reçu des données de séquençage brutes (par exemple, des chromatogrammes, des fichiers FASTQ), la phase suivante consiste à vérifier leur qualité, à appeler la séquence correcte et à confirmer que le résultat représente réellement votre gène cible. Une analyse médiocre ou des erreurs non vérifiées peuvent fausser vos conclusions. Dans cette section, je passe en revue les meilleures pratiques pour la validation de séquences basée à la fois sur Sanger et sur le séquençage de nouvelle génération (NGS).

6.1. Séquençage de Sanger : Évaluation des électrophorégrammes et des appels de bases

Pour le séquençage Sanger, la sortie principale est un chromatogramme (.ab1 ou similaire), montrant des pics de fluorescence à travers les positions de base. Les vérifications clés incluent :

• Aiguille de pointe et espacement : Idéalement, des pics bien résolus et symétriques sans queues qui se chevauchent.
• Bruit de base : Un signal de fond minimal entre les pics indique une lecture propre.
• Phasage et déclin : Au fil du temps, le signal peut s'affaiblir ; la qualité diminue souvent après environ 700 à 900 bases (meilleures pratiques du RTSF Genomics Core).
• Scores de qualité / appels de confiance : De nombreux spectateurs affichent des scores de qualité similaires à ceux de Phred pour chaque base ; signalent les positions de qualité inférieure (par exemple, < Q20).
• Pics ambigus ou doubles : Des pics mélangés ou superposés peuvent refléter l'hétérozygotie, la contamination ou des structures secondaires.
• Vérification de répétition directionnelle : Toujours séquencer à partir des amorces avant et arrière lorsque cela est possible, en particulier dans les régions critiques.

Si les appels de base sont ambigus ou de faible confiance, inspectez manuellement et envisagez de refaire le séquençage ou de concevoir des amorces alternatives.

Les directives de l'Association for Clinical Genomic Science (ACGS) soulignent l'importance de critères cohérents pour l'appel des variants, le signalement des bases incertaines et la communication de la confiance (bien que leur contexte soit clinique, les principes restent pertinents pour une utilisation rigoureuse en recherche).

Cas concret : Le Genomics Core de l'RTSF a publié des chromatogrammes contrastés "bons vs mauvais" pour montrer comment des concentrations incorrectes de modèle ou d'amorces dégradent les données.

6.2. NGS / Séquençage à haut débit: QC, Alignement et Appel de Variants

Lors de l'utilisation du séquençage NGS ou du séquençage massif parallèle, le pipeline d'analyse est plus complexe. Les principales étapes sont :

Contrôle de qualité (CQ) des lectures brutes (FASTQ)

• Coupez les séquences d'adaptateurs, les extrémités de faible qualité et supprimez les lectures en dessous du seuil de longueur.
• Évaluer les distributions de qualité de base (par exemple, via FastQC ou similaire).
• Filtrer ou signaler les lectures avec un nombre excessif de bases N ou une faible complexité.

Alignement / Cartographie à une référence

• La cartographie se fait sur un gène ou un génome de référence en utilisant des outils comme BWA, Bowtie2 ou minimap2.
• Considérez les discordances, les indels et les scores de qualité de mappage (MAPQ).

Séquence consensus / Appel de variantes

• Rassembler les lectures alignées, dériver une base consensuelle à chaque position (pour le séquençage d'amplicons).
• Appeler des variants à un seul nucléotide (SNVs) ou des indels en utilisant des appelants de variants (par exemple, GATK, FreeBayes, DeepVariant).
• Filtrer les variantes par des paramètres tels que la profondeur (DP), la fréquence allélique (AF), la qualité de base (QUAL), le biais de brin et le score de cartographie.

Validation et vérification croisée

Pour les positions incertaines ou les allèles à faible fréquence, vérifiez avec le séquençage Sanger (confirmation orthogonale). De nombreux laboratoires utilisent le Sanger pour valider 1 à 2 % des appels de variants ou ceux ambigus.

Notez que la littérature débat de l'exigence systématique de validation par Sanger ; une étude a montré qu'un seul tour de Sanger peut souvent réfuter incorrectement un appel NGS vrai positif plutôt que d'identifier des faux positifs (c'est-à-dire des faux négatifs).

Dans le contexte du séquençage du génome entier, une étude récente sur 1 756 variantes a trouvé environ 99,72 % de concordance entre le séquençage de génome entier (WGS) et le séquençage Sanger lorsque des seuils de haute qualité (QUAL ≥ 100, DP ≥ 20, fréquence allélique ≥ 0,2) ont été appliqués.

Le consensus en évolution est que les laboratoires devraient établir seuils de qualité internes pour quelles variantes une confirmation orthogonale est-elle requise, plutôt que de confirmer systématiquement tout.

Révision et Curation Manuelle

• Examine manuellement les appels de variants dans un visualiseur de génome (par exemple, IGV), en particulier autour des indels, des homopolymères ou des zones à faible couverture.
• Signalez les régions de faible couverture ou de cartographie ambiguë pour prudence ou re-séquençage.

6.3. Pièges courants et conseils de contrôle de la qualité

• Faible couverture / profondeur : Si la profondeur de lecture est trop faible, les appels de variants ne sont pas fiables - visez une couverture > 20× en séquençage d'amplicons.
• Biais de brin / biais de direction : Si la plupart des lectures soutenant une variante proviennent d'un seul brin, cela peut indiquer un artefact.
• Seuil de fréquence allélique variant (VAF) : Pour les gènes clonaux, le VAF devrait approcher ~100 % ; pour les échantillons mixtes ou hétérozygotes, attendez-vous à ~50 %. Un VAF très faible (< 5 %) signale souvent du bruit.
• Incohérences des variants : Utilisez plus d'un appelant de variants ou un filtrage de consensus pour réduire les faux positifs.
• Régions sujettes à erreurs : Les homopolymères, les séquences riches en GC et les motifs de structure secondaire peuvent entraîner des erreurs de lecture - interprétez avec prudence.
• Effets de lot et saut d'index (dans le séquençage NGS multiplexé) : Soyez conscient de la contamination croisée des échantillons ou de la mauvaise attribution des codes-barres.

Conseils pratiques — Éviter les erreurs courantes de séquençage génétique

Même avec un flux de travail solide, de petites erreurs ou négligences peuvent dégrader vos données de séquençage. Voici des conseils basés sur l'expérience et des meilleures pratiques pour réduire les erreurs, augmenter les taux de réussite et maintenir la reproductibilité.

7.1. Travailler avec des techniques et des contrôles propres

• Séparez les zones de travail pour les étapes pré- et post-PCR, avec des pipettes, des gants et des consommables dédiés.
• Utilisez des pointes filtrantes (aérosol) à chaque étape de pipetage pour éviter la contamination croisée.
• Incluez toujours des contrôles négatifs (sans modèle) lors des réactions de PCR et de séquençage.
• Pour les échantillons critiques, effectuez des réplicats techniques ou un séquençage en réplicat pour confirmer la cohérence.

7.2. Optimiser les concentrations de modèle et de amorce

• Trop de matériel génétique peut entraîner des pics de pull-up ou une saturation du signal dans les chromatogrammes Sanger. Eurofins avertit qu'un excès de matériel est une cause connue de distorsion des pics (par exemple, "signaux très forts et pics de pull-up").
• Trop peu de modèles produisent souvent un signal faible ou des traces illisibles.
• La concentration des amorces doit être équilibrée : un excès d'amorces peut produire des artefacts de dimères d'amorces, tandis qu'une quantité trop faible réduit le rendement.
• Reconcevoir les amorces si un chevauchement de liaison, une structure secondaire ou une liaison hors cible apparaissent.

7.3. Minimiser les artefacts introduits par la PCR

• Préférez des polymérases de haute fidélité et de relecture pour réduire les erreurs d'incorporation et les indels.
• Limiter le nombre de cycles pour éviter une sur-amplification, ce qui augmente les produits non spécifiques et l'accumulation d'erreurs.
• Utilisez des polymérases à démarrage rapide pour prévenir l'extension prématurée et l'amplification non spécifique à température ambiante.
• Pour les régions riches en GC ou sujettes à des structures, ajoutez des co-solvants (par exemple, DMSO, bétaïne) ou des tampons spécialisés.
• Évitez la "formation de chimères" dans les PCR multiplex ou à cycles élevés, qui peuvent créer des amplicons fusionnés ou trompeurs.

7.4. Surveiller et limiter les contaminants et les inhibiteurs

• Les résidus de l'extraction d'ADN (par exemple, sels, éthanol, phénol) peuvent inhiber les polymérases—assurez-vous que les étapes de lavage et d'élution sont complètes.
• Si une inhibition est suspectée, diluez votre échantillon ou purifiez-le à nouveau (par exemple, par précipitation à l'éthanol ou avec un kit de purification).
• Utilisez des réactifs fraîchement préparés, évitez les cycles de congélation-dégel répétés et jetez les stocks anciens ou suspects.
• Utilisez de l'eau ultrapure sans nucléase et vérifiez la présence de contaminants (par exemple, des nucléases, des nucléotides) dans les tampons ou les réactifs de stock.

7.5. Choisir le bon amorce de séquençage et la bonne stratégie

• Le primer utilisé dans le séquençage ("primer de séquençage par cycles") peut différer des primers de PCR—certains primers de PCR fonctionnent mal dans les réactions de séquençage linéaire.
• Dans les régions de homopolymères ou répétitives, envisagez des amorces ancrées, qui "verrouillent" la liaison à travers les répétitions et réduisent les artefacts de glissement.
• Séquence dans les deux sens, avant et arrière, lorsque cela est possible, en particulier sur des motifs difficiles ou des bases ambiguës.

7.6. Inspecter les chromatogrammes et contrôles de qualité préliminaires

• Utilisez un logiciel (par exemple, Sequence Scanner, TraceViewer) pour évaluer le rapport signal sur bruit, la séparation des pics, la dérive de la ligne de base et les taches de colorant.
• Surveillez les "pics mixtes", les espacements irréguliers ou les chutes de signal : cela peut indiquer une contamination, des problèmes de amorçage ou un mauvais amorçage.
• Si une lecture échoue ou est ambiguë dans une direction, re-séquence avec un nouvel amorce ou ajustez la quantité de modèle.

7.7. Documenter et enregistrer chaque condition

• Enregistrez toujours les numéros de lot (lot de kit, polymérase, lot de réactif) ainsi que les conditions exactes (températures, durées, concentrations).
• Inclure des métadonnées : échantillon source, date d'extraction, conditions de stockage.
• Au fil du temps, créez un journal des erreurs spécifique au laboratoire : vous pourriez détecter des tendances (par exemple, certains lots donnant de faibles rendements).

Liste de contrôle des outils et des réactifs

Voici une liste consolidée des outils, réactifs et consommables essentiels pour effectuer le séquençage de gènes via PCR et le séquençage en aval. Utilisez cela comme référence rapide en laboratoire et dans le cadre de votre documentation SOP interne.

Conclusion

Le séquençage d'un gène est un parcours étape par étape, allant du matériel de départ à une séquence propre et validée. En suivant méthodiquement le flux de travail (extraction d'ADN → amplification par PCR → purification → séquençage → analyse) et en appliquant les conseils pratiques décrits ci-dessus, vous maximisez le succès et la reproductibilité de vos expériences.

Dans les laboratoires de recherche et les CRO, de petites erreurs (contamination, amorces suboptimales, nettoyage incomplet) peuvent souvent compromettre les résultats de séquençage. Cependant, en appliquant de bonnes pratiques de laboratoire, en vérifiant rigoureusement la qualité de l'ADN et en choisissant la bonne méthode de séquençage (Sanger, NGS à courtes lectures ou à longues lectures), vous pouvez réduire les taux d'échec et améliorer la fiabilité des données.

Si votre projet implique plusieurs gènes, un séquençage par panel, ou nécessite une sensibilité aux variants plus profonde ou des informations structurelles, vous pourriez envisager d'externaliser une partie ou la totalité de votre flux de travail à un fournisseur de services en génomique spécialisé. Par exemple, chez CD GenomicsNous proposons des services de séquençage complets, allant du contrôle qualité des échantillons, au séquençage, jusqu'à la livraison bioinformatique, adaptés aux clients académiques, industriels et pharmaceutiques.

Prochaines étapes (Action) :

Si vous préférez vous concentrer sur votre science et laisser l'exécution du séquençage à des experts, contactez-nous pour une consultation ou demandez un devis pour votre projet.

•  Pour approfondir votre compréhension, explorez ces articles connexes dans notre bibliothèque de contenu :
• Comment concevoir des amorces pour le séquençage de l'ADN : un guide pratique (stratégies de base)
• Préparation des échantillons pour des résultats de séquençage de haute qualité Meilleures pratiques pour l'extraction d'ADN
• Stratégies de préparation de bibliothèque pour le séquençage de nouvelle génération (pour l'adaptation aux flux de travail NGS)

Laissez-nous vous aider à passer de l'échantillon à la séquence en toute confiance.

Questions Fréquemment Posées (FAQ)

Q : Comment séquencer un gène de A à Z ?

Pour séquencer un gène, vous devez d'abord extraire de l'ADN de haute qualité de votre échantillon, puis amplifier votre région cible par PCR, nettoyer le produit de PCR pour éliminer les amorces résiduelles et les dNTPs, choisir une méthode de séquençage appropriée (par exemple, Sanger ou NGS), envoyer l'amplicon purifié au séquençage, et enfin valider le résultat en analysant les chromatogrammes ou les appels de bases et en confirmant avec un alignement de référence ou des méthodes orthogonales.

Q : Quels facteurs affectent le plus le succès du séquençage ?

Les déterminants clés incluent la qualité de l'ADN (pureté, intégrité, absence d'inhibiteurs), la spécificité et la conception des amorces, l'efficacité de la PCR (réactifs corrects, cycles et enzyme), une purification approfondie de l'amplicon, et une profondeur de séquençage appropriée ou une qualité de lecture ; lorsque l'une de ces étapes est faible, la séquence finale peut être bruyante, ambiguë ou échouer complètement.

Q : Les produits de PCR peuvent-ils être séquencés directement sans étapes supplémentaires ?

Seulement si le rendement de la PCR est extrêmement pur (une seule bande sans dimères d'amorces ni produits non spécifiques). Dans la plupart des expériences du monde réel, le nettoyage est essentiel. Les amorces non éliminées, les dNTP ou les résidus de polymérase peuvent interférer avec la chimie de séquençage et dégrader la qualité des lectures, donc la purification avant le séquençage est généralement obligatoire.

Q : Comment choisir entre le séquençage Sanger et le NGS pour un gène ?

Utilisez Sanger lorsque vous avez un ou quelques amplicons et que vous avez besoin d'une très haute précision avec un faible débit. Choisissez NGS lorsque de nombreux gènes, de nombreux échantillons ou des panels multiplexés sont nécessaires - NGS offre évolutivité et profondeur, au prix de données et de préparation de bibliothèque plus complexes.

Q : Qu'est-ce que le "primer walking" et quand est-il utilisé ?

La marche de primers est une méthode dans laquelle des primers séquentiels sont conçus pour "marcher le long" du modèle d'ADN afin de couvrir une région plus longue qu'une seule lecture ne peut atteindre ; après le séquençage initial, de nouveaux primers sont conçus à côté de la dernière base connue, et le segment suivant est séquencé, continuant de manière itérative jusqu'à ce que l'ensemble de la séquence soit couvert (Wikipedia : Marche de primers).

Q : Comment puis-je savoir si mon résultat de séquençage est fiable ?

Vérifiez les indicateurs de qualité tels que les pics aigus, le bruit minimal dans les chromatogrammes pour le Sanger, ou la profondeur de lecture, les scores de qualité des bases et la cohérence de l'alignement dans le NGS. Comparez également votre séquence à une référence ou une base de données de confiance et, si nécessaire, confirmez les variants ambigus ou nouveaux à l'aide d'une seconde méthode ou d'un séquençage répété.

Q : Quelle est la différence entre le séquençage de gènes complets et le séquençage par panel ou par exome ?

Le séquençage complet de gènes se concentre sur une région étroite (le gène d'intérêt), en utilisant la PCR ciblée ou la capture, tandis que le séquençage par panel couvre un groupe de gènes, et le séquençage de l'exome englobe toutes les régions codantes de nombreux gènes. L'accent plus profond sur le séquençage des gènes produit généralement une couverture plus élevée et des pipelines d'analyse plus simples.

Q : Que devrais-je faire si une région ne parvient pas à se séquencer ou montre des appels ambigus ?

Vous pouvez redessiner les amorces (en particulier les amorces internes), diviser l'amplicon en fragments chevauchants, réduire la structure secondaire grâce à des additifs (par exemple, le DMSO) ou appliquer des stratégies de séquençage alternatives (par exemple, des lectures longues). Le re-séquençage dans les deux directions, avant et arrière, aide souvent à résoudre l'ambiguïté.

Référence :

1. Thornton B, Basu C. Conception de primers pour la PCR en temps réel (qPCR) à l'aide de logiciels en ligne gratuits. Éducation en biochimie et biologie moléculaire : une publication bimensuelle de l'Union internationale de biochimie et biologie moléculaire2011 Mar-Avr;39(2):145-154. DOI : 10.1002/bmb.20461. PMID : 21445907.
2. Henriette O'Geen, Marketa Tomkova, Jacquelyn A Combs, Emma K Tilley, David J Segal, Déterminants du silençage génique héréditaire pour l'édition épigénomique hit-and-run KRAB-dCas9 + DNMT3 et Ezh2-dCas9 + DNMT3, Recherche sur les acides nucléiquesVolume 50, Numéro 6, 8 avril 2022, Pages 3239–3253
3. Wright CF, Morelli MJ, Thébaud G, Knowles NJ, Herzyk P, Paton DJ, Haydon DT, King DP. Au-delà du consensus : disséquer la diversité des populations virales intra-hôte du virus de la fièvre aphteuse en utilisant le séquençage génomique de nouvelle génération.. J Virol. Mars 2011;85(5):2266-75. doi: 10.1128/JVI.01396-10. Publié en ligne le 15 décembre 2010. PMID: 21159860; PMCID: PMC3067773.
4. Kopernik, A., Sayganova, M., Zobkova, G. et al. Validation Sanger des variants WGS. Sci Rep quinze, 3621 (2025).