Contrôle de qualité dans le flux de travail de préparation de bibliothèques NGS

le séquençage de nouvelle génération (NGS) a révolutionné la génomique, permettant aux chercheurs d'explorer les complexités de l'ADN et de l'ARN à une échelle sans précédent. Cependant, le succès du NGS dépend fortement de la qualité des bibliothèques préparées. Pour optimiser le temps et les ressources, des contrôles de qualité (CQ) efficaces sont indispensables à des étapes cruciales du flux de travail de préparation des bibliothèques. La mise en œuvre de mesures de CQ avant et après diverses étapes du processus garantit des échantillons de haute qualité, minimise les erreurs coûteuses et améliore le succès global de NGS expériences.

Séquençage de nouvelle génération. (Hess et al., 2020)

L'importance de la qualité des échantillons dans la préparation de bibliothèques NGS

La préparation de bibliothèques NGS implique plusieurs étapes critiques, y compris la fragmentation des échantillons, la ligature des adaptateurs de séquençage et l'amplification de la bibliothèque. La qualité des échantillons de départ a un impact significatif sur le succès de ces étapes et, par conséquent, sur les résultats du séquençage. Des échantillons de mauvaise qualité ou insuffisamment concentrés peuvent entraîner des données biaisées ou peu fiables, risquant ainsi de gaspiller des ressources précieuses et de retarder les résultats de la recherche. En effectuant des contrôles de qualité tout au long du processus, les chercheurs peuvent identifier les problèmes potentiels dès le début et optimiser leurs protocoles pour des résultats optimaux.

Veuillez vous référer à notre Directives de Soumission d'Échantillons pour plus de détails.

Contrôle de qualité des matériaux de départ dans la préparation de bibliothèques NGS

Le succès du NGS repose fortement sur la qualité des matériaux de départ utilisés dans le processus de préparation de la bibliothèque. Un contrôle de qualité (CQ) adéquat des matériaux de départ, qu'il s'agisse d'ADN ou d'ARN, est la première étape cruciale pour préparer des bibliothèques de haute qualité et obtenir des résultats de séquençage réussis.

Le matériau de départ, tel que l'ADN génomique ou ARN total, sert de fondation pour la construction de bibliothèques NGS. Il est essentiel d'évaluer la qualité et la quantité de ces échantillons avant de commencer la préparation de la bibliothèque. Des matériaux de départ de haute qualité ont un impact significatif sur les processus en aval, garantissant des données de séquençage précises et représentatives. À l'inverse, des échantillons dégradés ou de faible qualité peuvent entraîner des résultats biaisés, une perte de matériel de séquençage précieux et une complexité de bibliothèque compromise.

Paramètres QC critiques pour le matériel de départ :

• Quantité : Une quantification précise du matériau de départ est essentielle pour déterminer la quantité appropriée nécessaire à la préparation de la bibliothèque. Les kits de préparation de bibliothèque NGS recommandent souvent des concentrations et des quantités de départ spécifiques pour optimiser les résultats de séquençage. Une quantification précise garantit que la bibliothèque n'est ni sous- ni sur-séquencée, ce qui conduit à une couverture optimale et à une génération de données.
• Pureté : La pureté du matériau de départ est évaluée en mesurant les rapports d'absorbance à des longueurs d'onde spécifiques, généralement A260/A280 et A260/A230. Un rapport A260/A280 proche de 1,8 et un rapport A260/A230 autour de 2,0 indiquent une contamination minimale par des protéines, des composés organiques ou des sels. Les contaminants peuvent interférer avec les réactions enzymatiques lors de la préparation de la bibliothèque, ce qui peut affecter l'analyse en aval.
• Intégrité : L'intégrité de l'échantillon d'acide nucléique est cruciale pour une préparation de bibliothèque réussie. Pour les échantillons d'ARN, le nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) ou le nombre de qualité de l'ARN (RQN) peuvent être déterminés à l'aide de techniques telles que l'électrophorèse capillaire. Des scores RIN/RQN élevés indiquent des molécules d'ARN intactes, tandis que l'ARN dégradé peut entraîner une construction de bibliothèque fragmentée et biaisée.

Reproductibilité : Assurer que le matériel de départ est reproductible est essentiel, en particulier dans les études à échantillons multiples. Les répliques du même échantillon devraient donner des valeurs de contrôle qualité cohérentes afin de minimiser la variabilité technique lors de la préparation de la bibliothèque.

Points de contrôle QC dans la préparation de bibliothèques NGS

Pour garantir des données de séquençage précises et fiables, il est crucial de mettre en œuvre des points de contrôle de qualité (QC) à différentes étapes du processus de préparation de la bibliothèque NGS. Cet article souligne l'importance du QC à divers moments du flux de travail pour garantir la création de bibliothèques de haute qualité pour un séquençage réussi.

Points de contrôle QC dans la préparation de bibliothèques NGS :

• Échantillon QC

L'étape initiale de contrôle qualité consiste à évaluer la qualité et la quantité des échantillons d'acides nucléiques de départ (ADN ou ARN) avant la préparation de la bibliothèque. Une quantification précise, une évaluation de la pureté et des contrôles d'intégrité des échantillons sont essentiels pour éviter d'introduire des biais et garantir une représentation optimale du matériel original dans la bibliothèque.

• Contrôle qualité de la fragmentation

Après quantification, les échantillons subissent une fragmentation, les décomposant en fragments d'ADN ou d'ARN plus petits. Le contrôle qualité à ce stade confirme que le processus de fragmentation a été réussi et que la distribution de taille des fragments est dans la plage souhaitée pour l'expérience spécifique.

• Contrôle de qualité de la ligature de splice

Après la fragmentation, les adaptateurs de séquençage sont ligaturés à l'ADN ou à l'ARN fragmenté. Des contrôles de qualité sont effectués pour valider l'efficacité du processus de ligature et s'assurer que les adaptateurs sont correctement incorporés, facilitant ainsi leur attachement approprié à la plateforme de séquençage.

• Contrôle qualité de l'amplification

L'amplification par PCR est une étape cruciale pour enrichir la bibliothèque avec du matériel prêt pour le séquençage. Les contrôles de qualité à ce stade vérifient que l'amplification a réussi sans sur-amplification ni sous-amplification, ce qui peut introduire des biais et affecter la complexité de la bibliothèque.

• Détection de dimères d'adaptateurs

Tout au long du processus de préparation de la bibliothèque, il est essentiel de surveiller et de détecter la présence de dimères d'adaptateurs. Ces artefacts peuvent se former lorsque des adaptateurs en excès se lient ensemble, réduisant la représentation du matériel original dans la bibliothèque. Des contrôles de qualité sont effectués pour minimiser le contenu en dimères d'adaptateurs, garantissant une bibliothèque de haute qualité.

• Contrôle de qualité de la mise en commun de bibliothèques

Dans les études à échantillons multiples, les bibliothèques sont souvent regroupées pour un séquençage multiplexé. Le contrôle de qualité du regroupement implique de quantifier et de normaliser la concentration des bibliothèques individuelles afin d'assurer une représentation égale de chaque échantillon, maximisant ainsi l'efficacité du séquençage et le rendement des données.

QC pour la bibliothèque NGS finale

La dernière étape du processus de préparation de la bibliothèque NGS est l'amplification par PCR, une étape cruciale qui génère un nombre suffisant de copies de la bibliothèque pour le séquençage ultérieur. Au cours de cette étape, la ligation des adaptateurs de séquençage à l'ADN ou à l'ARN fragmenté est confirmée, et l'amplification par PCR est utilisée pour enrichir les fragments d'ADN cibles. Le contrôle de qualité (CQ) de la bibliothèque NGS finale est essentiel pour garantir le succès de la course de séquençage, identifier les problèmes potentiels et obtenir des données de séquençage fiables et de haute qualité.

Importance du contrôle qualité pour la bibliothèque NGS finale :

La bibliothèque NGS finale représente les fragments d'ADN ou d'ARN qui sont prêts pour le séquençage. Évaluer la qualité de la bibliothèque à ce stade est crucial car cela détermine le succès de la course de séquençage suivante. Le contrôle qualité de la bibliothèque finale aide à :

• Vérifiez la préparation réussie de la bibliothèque : Confirmez que la ligation des adaptateurs de séquençage et d'autres étapes de préparation de la bibliothèque ont été réussies, en vous assurant que la bibliothèque est adaptée au séquençage.
• Détecter les dimères d'adaptateurs : Identifier la présence d'excès de primers ou de dimères d'adaptateurs, qui peuvent interférer avec le processus de séquençage et conduire à une mauvaise représentation de l'échantillon original.
• Évaluer l'efficacité de l'amplification : Déterminez si la bibliothèque a été suffisamment amplifiée. Une sur-amplification peut entraîner une augmentation des doublons et des biais, tandis qu'une sous-amplification peut conduire à une représentation insuffisante et à un rendement de séquençage réduit.
• Optimiser le regroupement des bibliothèques : Quantifier la concentration et la concentration molaire de la bibliothèque pour faciliter le regroupement approprié de plusieurs bibliothèques pour le séquençage multiplexé, en garantissant une représentation égale de chaque échantillon.

Méthodes de CQ pour la bibliothèque NGS finale :

• Électrophorèse : Les plateformes d'électrophorèse automatisées, telles que Bioanalyzer ou TapeStation, sont couramment utilisées pour l'analyse de la taille des fragments de la bibliothèque finale. La présence d'un pic de dispersion de bibliothèque propre confirme une préparation de bibliothèque réussie, tandis que la présence de pics supplémentaires indique la présence de dimères d'adaptateurs ou d'autres contaminants.
• Quantification : Les méthodes fluorométriques comme Qubit ou qPCR peuvent quantifier avec précision la concentration et la concentration molaire de la bibliothèque, permettant un regroupement précis des bibliothèques pour le séquençage.

Analyse de la complexité de la bibliothèque : Des techniques telles que les codes-barres moléculaires ou d'autres stratégies d'indexation peuvent être utilisées pour évaluer la complexité de la bibliothèque et détecter les duplicats PCR, ce qui est essentiel pour détecter et corriger les biais potentiels introduits lors de l'amplification PCR.

Référence :

1. Hess, Jacob Friedrich, et al. "Préparation de bibliothèque pour le séquençage de nouvelle génération : un examen des stratégies d'automatisation." Avancées en biotechnologie 41 (2020) : 107537.