Introduction à Iso-Seq : Révéler les Transcrits Complets avec PacBio

La transcriptomique est un domaine crucial de la recherche biologique, dédié à l'exploration de l'expression génique et de ses mécanismes de régulation. Au cœur de ce domaine se trouve l'analyse complète des motifs d'expression génique à travers divers tissus, cellules ou conditions expérimentales. Les technologies de séquençage à lecture courte et longue de l'ARN, telles que celles proposées par Illumina, rencontrent des limitations dues à la fragmentation. Cette fragmentation empêche la couverture complète des transcrits de pleine longueur, entraînant un épissage de séquence incomplet et une annotation génique inexacte. En revanche, le séquençage de transcrits de pleine longueur fournit des informations complètes sur les transcrits, y compris les exons 5' et 3', les introns et les queues poly-A. Ces informations détaillées permettent une compréhension plus approfondie de l'expression génique et des mécanismes de régulation.

Iso-Seq la technologie est une méthode de séquençage de transcriptome complet basée sur séquençage en temps réel à molécule unique (SMRT), qui a été développé par la société PacBio. En synthétisant la bibliothèque de cDNA pleine longueur, cette technologie peut capturer directement la séquence complète des transcrits grâce à sa capacité de lecture super longue (la longueur moyenne peut atteindre 10-15 kb) sans dépendre du génome de référence. La technologie Iso-Seq présente des avantages significatifs dans le séquençage des transcrits pleine longueur, tels que :

Haute précision dans la détectionIso-Seq met en avant une précision remarquable dans l'identification des événements d'épissage, des isoformes de transcrits, des gènes de fusion et des ARN non codants. Cette précision offre aux chercheurs une vue plus nuancée et précise du transcriptome, permettant une compréhension plus approfondie de la fonction et de la régulation des gènes.

Couverture complète des transcriptionsCouvrant la transcription complète de l'extrémité 5' à l'extrémité 3', y compris les introns et la queue poly-A, ce qui est utile pour analyser la structure complexe du transcriptome.

Polyvalence dans l'applicationIl est adapté au séquençage transcriptomique complet d'espèces sans génome de référence et prend en charge l'analyse parallèle d'échantillons multi-tissulaires.

Effets améliorés grâce à l'interfrationLa combinaison avec d'autres technologies de séquençage (comme l'ARN-seq) peut encore améliorer la capacité d'analyse des données du transcriptome.

PacBio est le principal promoteur et leader de la technologie Iso-Seq. La série Sequel II, sa plateforme de séquençage de troisième génération, a considérablement amélioré la précision et la cohérence des transcrits complets grâce à une technologie de séquençage HiFi optimisée. La technologie Iso-Seq de PacBio est non seulement largement utilisée dans la recherche académique, mais aussi pour l'annotation génomique et l'analyse transcriptomique des plantes, des animaux et des humains.

De plus, PacBio a développé une variété d'outils et de logiciels de support (tels que SMRT Link, IsoCon, TAMA, etc.) pour nous fournir une solution complète, de la préparation des échantillons à l'analyse des données.

Qu'est-ce que l'Iso-Seq ?

Le séquençage des isoformes (Iso-Seq) est une méthode de séquençage de transcrits en longueur complète basée sur la technologie SMRT, développée par PacBio. Cette technologie vise à capturer et analyser les séquences complètes des différentes isoformes dans le génome, fournissant ainsi des informations transcriptomiques plus complètes. Ce qui suit décrit un principe schématique de l'Iso-Seq.

SMRT : SMRT est une technologie de séquençage de troisième génération, qui effectue le séquençage en capturant des modèles d'ADN dans un guide d'onde à mode zéro (Zero-Mode Waveguide, ZMW). Cette méthode ne nécessite pas d'interrompre les fragments d'ADN, mais séquence directement une seule molécule d'ADN, permettant ainsi de générer une séquence de lecture longue (généralement 10 kb ou plus) et peut capturer complètement le transcript complet depuis l'extrémité 5' jusqu'à l'extrémité poly-A.

Aperçu de la technologie de séquençage SMRT (Simon et al., 2018)

La technologie Iso-Seq peut générer des séquences de transcrits complets de haute qualité en séquençant l'ADNc directement sans interruption ni épissage. Ces séquences incluent des informations complètes depuis l'extrémité 5' jusqu'à l'extrémité poly-A, ce qui permet aux chercheurs d'analyser avec précision les variants d'épissage, les sites d'initiation, les sites de terminaison et les événements de régulation post-transcriptionnelle tels que l'épissage alternatif et la polyadénylation (APA).

La technologie Iso-Seq de PacBio est une méthode de séquençage de transcriptome en longueur complète basée sur SMRT. Son principal avantage est qu'elle peut séquencer des transcrits en longueur complète sans épissage ni inférence, fournissant ainsi une analyse plus précise de l'expression génique et des isomères de transcrits. La technologie SMRT de PacBio est une technologie de séquençage de troisième génération, qui génère de longues séquences de lecture en surveillant le processus de synthèse de l'ADN en temps réel. Son composant principal est la cellule SMRT, qui est un petit consommable contenant des millions de guides d'ondes en mode zéro (ZMW) pour capturer les molécules d'ADN et enregistrer le processus d'ajout de nucléotides en temps réel. Cette technique peut générer des séquences allant jusqu'à 10 kb ou même plus, avec une précision allant jusqu'à 99 %.

Le séquençage PacBio se caractérise par sa haute précision et sa capacité de lecture longue. Sa longueur de lecture moyenne se situe généralement entre 8 et 15 kb, et les plus longues peuvent atteindre 40 à 70 kb. Cette longueur de lecture importante rend PacBio particulièrement adapté à l'étude des variants d'épissage et des gènes de fusion dans des régions génomiques complexes, des séquences répétitives et le transcriptome.

Avantages de l'Iso-Seq

• Capacité de lecture longue : Iso-Seq peut générer un segment de lecture aussi long que 10 kb, voire plus, ce qui lui confère des avantages significatifs dans la détection d'isomères complexes et d'ARN non codants longs (lncRNA) dans le génome. En revanche, les techniques traditionnelles de lecture courte et de séquençage long (comme l'ARN-seq) ne peuvent pas capturer complètement les transcrits de longueur complète en raison des limitations de fragmentation.
• Séquençage direct des transcrits complets : Iso-Seq peut générer des séquences de transcrits complets sans épissage ni assemblage, ce qui simplifie considérablement le processus d'analyse des données et réduit les résultats faussement positifs causés par des erreurs d'épissage. Cette méthode est particulièrement adaptée à l'étude de l'annotation du génome, à la découverte de nouveaux gènes, à la détection de variants d'épissage et à l'analyse des événements d'épissage alternatif et de polyadénylation.
• Réduire la complexité de l'assemblage : Parce qu'Iso-Seq peut générer directement des séquences complètes de haute qualité, il n'est pas nécessaire de s'appuyer sur des algorithmes d'épissage complexes pour reconstruire la structure des transcrits. Cela améliore non seulement l'exactitude des données, mais réduit également la demande en ressources informatiques, permettant ainsi aux chercheurs d'analyser les données du transcriptome de manière plus efficace.
• En essence, Iso-Seq représente une avancée puissante dans la technologie de séquençage des transcrits. En capturant et en séquençant directement des cDNA de pleine longueur, il génère des séquences de transcrits de haute qualité sans interruption ni épissage. Sa capacité de lecture longue et son approche sans assemblage offrent des avantages significatifs dans l'annotation génomique, la découverte de nouveaux gènes, la détection de variantes d'épissage et l'analyse des événements régulateurs post-transcriptionnels.

Applications Iso-Seq dans l'analyse génomique

Iso-Seq est un outil de bioinformatique basé sur le séquençage d'ARN en longueur complète, qui est largement utilisé dans de nombreux domaines. Voici des applications spécifiques d'Iso-Seq dans différents domaines.

Découverte et annotation des gènes

Amélioration de l'annotation du génome entier : Iso-Seq peut générer une séquence de transcrit complète, ce qui est particulièrement important pour les nouvelles espèces ou les génomes partiellement séquencés. En comparant avec le génome de référence, Iso-Seq peut localiser avec précision les frontières des exons, les sites d'épissage et les sites de connexion d'épissage alternatif, améliorant ainsi l'exactitude de l'annotation des gènes.

Découverte de nouveaux gènes et isoformes : Iso-Seq peut détecter de nombreux transcrits non commentés, y compris de nouveaux gènes, des isomères (tels que AS, APA) et des gènes de fusion. Cela fournit un soutien de données abondant pour la recherche génomique.

Élever la qualité de l'annotation : Comparé aux méthodes traditionnelles de balisage de séquence d'expression (EST), de RNA-Seq et d'inférence homologue, Iso-Seq peut annoter les gènes de manière plus précise grâce à ses données de séquence continues.

Représentation schématique de l'AS et de l'APA (An et al., 2018)

Recherche sur l'épissage alternatif

Détection des événements d'épissage alternatif (AS) : Iso-Seq peut détecter directement les événements d'épissage alternatif, y compris la rétention d'intron, le saut d'exon et la suppression d'exon. Ces données sont utiles pour comprendre le mécanisme de régulation de l'expression génique.

L'investigation de la polyadénylation alternative (APA) : Iso-Seq peut détecter des événements d'APA dans différents tissus ou conditions, et révéler le mécanisme de régulation post-transcriptionnelle dans différents types de cellules ou états physiologiques.

Quantification du splicing différentiel : En comparant les données du transcriptome de différents échantillons, Iso-Seq peut analyser quantitativement les événements de splicing différentiel et leurs effets fonctionnels, et fournir un soutien pour le diagnostic des maladies et le développement de biomarqueurs.

Un échantillon de résultats de recherche sur l'épissage alternatif (Nicola et al., 2014)

Analyse du transcriptome et des isomères

Simplification de l'assemblage et de l'annotation du transcriptome : Les données de séquence pleine longueur générées par Iso-Seq évitent la complexité de l'assemblage du transcriptome et améliorent l'intégrité du transcript, reflétant ainsi plus précisément le niveau d'expression génique et le mécanisme de régulation post-transcriptionnelle.

Profilage de l'expression des isoformes : En utilisant les données Iso-Seq, nous pouvons analyser avec précision les schémas d'expression des différentes isoformes, y compris l'expression spécifique aux tissus et la réponse au stress.

Faire progresser l'étude des ARN non codants longs (lncRNA) : Iso-Seq peut détecter et annoter les lncRNA, ce qui constitue un outil important pour comprendre leur rôle dans la régulation des gènes.

Mise à jour de l'annotation de référence de la laitue par HIT-ISOseq (Shi et al., 2024)

Génomique comparative

Découverte des différences inter-espèces : En comparant les données Iso-Seq de différentes espèces, il est possible de révéler des motifs d'expression génique spécifiques à chaque espèce et des mécanismes de régulation post-transcriptionnelle. Par exemple, des études ont montré qu'Iso-Seq peut identifier des transcrits uniques et des isomères d'épissage lors de la comparaison de différentes espèces végétales.

Suivi des changements évolutifs : Les données Iso-Seq sont utiles pour analyser les changements de la structure et de la fonction du génome au cours de l'évolution des espèces, en particulier en l'absence de génome de référence.

En tant que technologie avancée de séquençage d'ARN, Iso-Seq présente de larges perspectives d'application. Elle peut non seulement améliorer la précision et l'exhaustivité de l'annotation des gènes, mais aussi étudier en profondeur les fonctions du splicing alternatif, des isomères du transcriptome et des ARN non codants longs. De plus, Iso-Seq montre également un grand potentiel en génomique comparative et en recherche évolutive. Cependant, en raison de son coût élevé, son application à grande échelle fait encore face à certains défis.

Pour des informations plus détaillées, veuillez vous référer aux articles :

• Applications de l'Iso-Seq dans la recherche en génomique et en transcriptomique
• Le pouvoir de l'Iso-Seq dans la découverte et l'annotation des gènes

Protocole Iso-Seq de base

Iso-seq, c'est-à-dire le séquençage de transcrits complets, est une méthode de séquençage basée sur la technologie de séquençage en temps réel à molécule unique de PacBio, et son flux comprend principalement les étapes clés suivantes :

Préparation de l'échantillon

Extraction d'ARN et assurance qualité : L'extraction d'ARN est une étape clé dans le séquençage du transcriptome. En général, des méthodes spécifiques sont utilisées pour séparer les molécules d'ARN des échantillons et éliminer les impuretés inutiles. Par exemple, la digestion par DNase I est utilisée pour éliminer la contamination par l'ADN, puis l'ARN est purifié davantage à l'aide de billes magnétiques. L'ARN extrait nécessite un contrôle de qualité, y compris l'utilisation de Qubit ou d'Agilent Bioanalyzer pour détecter la concentration et l'intégrité de l'ARN.

Synthèse de cDNA : Transcription inverse de l'ARN en cDNA (ADN complémentaire) pour une analyse ultérieure. Les méthodes couramment utilisées incluent l'utilisation du kit de synthèse de cDNA SMARTer Total RNA-Seq, qui peut transcrire inversement l'ARN à l'extrémité du poly(A) en cDNA. Dans le processus de synthèse de cDNA, un adaptateur spécial est généralement ajouté pour l'amplification PCR ultérieure et la construction de la bibliothèque.

Étapes de préparation de la bibliothèque Iso-Seq (Marta et al., 2020)

Séquençage et génération de données

Préparation de bibliothèque PacBio : La bibliothèque est préparée en connectant des fragments d'ADNc à des vecteurs adaptés au séquençage. Par exemple, une bibliothèque a été préparée en utilisant le modèle de linker SMARTer P5/P7 et amplifiée par le système PCR KAPA HiFi HotStart. La bibliothèque amplifiée doit subir un contrôle de qualité pour s'assurer qu'elle est adaptée au séquençage. Par exemple, la concentration de la bibliothèque a été déterminée à l'aide de l'essai Qubit BR DNA HS, et la taille a été sélectionnée par E-gel.

Opération de séquençage et collecte de données : La plateforme de séquençage PacBio Sequel II a été utilisée pour le séquençage. Pendant le séquençage, plusieurs cellules SMRT peuvent être utilisées pour un séquençage parallèle afin d'améliorer la couverture des données. Une fois le séquençage terminé, les Subreads générés doivent être contrôlés pour la qualité et coupés afin d'éliminer les fragments de séquence de faible qualité ou erronés.

Processus d'analyse des données

Prétraitement des données : Un contrôle de qualité a été effectué sur les données de séquençage originales pour éliminer les segments de lecture de faible qualité et les séquences de liaison. Utilisez des outils tels que Trimmomatic ou Cutadapt pour couper les données afin d'assurer la qualité des données.

Identification et annotation de transcrits complets : En utilisant la technologie Iso-Seq de PacBio, les données sont épissées et annotées par le logiciel SMRT Analysis (tel que SMRT analysis) pour générer des transcrits complets (y compris les régions UTR 5' et 3'). La structure et la fonction des transcrits ont été analysées plus en détail en comparant des génomes de référence ou en utilisant la méthode d'assemblage de novo.

Analyse des données en aval : l'analyse comprend l'analyse de l'expression différentielle, la détection d'événements d'épissage alternatif et l'analyse des sites d'initiation de la transcription. Par exemple, utilisez des outils tels que DESeq2 et EdgeR pour effectuer l'analyse de l'expression différentielle. Les résultats de visualisation peuvent être affichés par des cartes volcaniques, des cartes thermiques et d'autres méthodes pour aider les chercheurs à comprendre les différences d'expression génique dans différentes conditions.

Pipelines de traitement et d'analyse des données pour les données RNA-seq et les données Iso-Seq (Jiang et al., 2017)

Sur la base des étapes ci-dessus, le protocole Iso-Seq complet comprend la préparation des échantillons, la préparation de la bibliothèque, l'opération de séquençage et l'analyse des données. Ce processus peut générer des données de transcrits complets de haute qualité et fournir un soutien d'information complet pour la recherche sur le transcriptome.

Pour des informations plus détaillées, veuillez consulter l'article :

• Guide étape par étape du protocole Iso-Seq : de la préparation de l'échantillon à l'analyse des données

Conclusion

L'Iso-Seq est une méthode de séquençage de transcrits en longueur complète basée sur la technologie de séquençage de troisième génération, développée par PacBio. En fournissant une séquence cDNA complète, elle évite l'étape de reconstruction du transcriptome dans le séquençage RNA traditionnel (tel que RNA-seq), améliorant ainsi la précision et l'exhaustivité de l'annotation des transcrits. Iso-Seq peut générer un segment de lecture complet et non répétitif (FLNC) allant jusqu'à 10 kb, couvrant toutes les régions depuis la coiffe 5' jusqu'à la queue de polyadénylation, ce qui constitue un avantage significatif pour révéler la complexité du transcriptome.

Néanmoins, l'Iso-Seq présente également certaines limites, telles qu'un coût plus élevé et une production inférieure. Cependant, avec les progrès de la technologie et la réduction des coûts, l'Iso-Seq devrait devenir un outil important pour la recherche sur le transcriptome.

À l'avenir, le développement de la technologie Iso-Seq aura un impact considérable sur la recherche en génomique. Voici plusieurs directions de développement possibles et leurs impacts potentiels :

Intégration de plusieurs technologies de séquençage : Combinaison de lectures courtes et technologies de séquençage long (tels que RNA-seq et Iso-seq) aideront à surmonter leurs limitations techniques respectives. Par exemple, en intégrant les données de RNA-seq à lecture courte et d'Iso-seq à lecture longue, les chercheurs peuvent analyser de manière plus complète la complexité du transcriptome et améliorer la précision de l'annotation des gènes.

Application à plus d'espèces : Avec la popularisation de la technologie Iso-Seq, son application chez les espèces non modèles sera plus étendue. Par exemple, dans la recherche sur les organismes marins, les insectes et les plantes, la technologie Iso-Seq aidera à révéler les caractéristiques génomiques uniques et les mécanismes évolutifs de ces espèces.

Soutenir la médecine personnalisée : Avec l'approfondissement de la recherche en génomique, la technologie Iso-Seq pourrait jouer un rôle important dans la médecine personnalisée. Par exemple, en analysant les données du transcriptome d'un individu, un schéma plus personnalisé peut être proposé pour un diagnostic et un traitement précis.

La technologie Iso-Seq devient de plus en plus importante dans la recherche sur le transcriptome, et son développement futur favorisera grandement les avancées de la recherche génomique et apportera de nouvelles opportunités à la biologie, à la médecine et à d'autres domaines.

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