Aperçu du séquençage bisulfite à représentation réduite de l'ADN circulant (cfDNA-RRBS)

Méthylation de l'ADN libre circulant (cfDNA)

La recherche dans le domaine de l'épigénétique a révélé que les modifications de méthylation sont fréquemment présentes dans les génomes des mammifères, principalement sous la forme de 5mCCette modification survient lorsque l'atome de carbone en position 5 de la cytosine C se combine avec un groupe méthyle (CH3) sous l'influence d'une enzyme méthyltransférase. De telles modifications de méthylation ont démontré leur influence sur l'expression des gènes, exerçant ainsi un contrôle régulateur sur le destin cellulaire et impactant par la suite l'apparition de maladies.

Lors des phases initiales du développement de la maladie, ADN libre circulant (cfDNA) peut être libéré par la lyse cellulaire autonome ou la lyse passive de cellules malades reconnues par le système immunitaire. L'ADNc libéré, dans une certaine mesure, encapsule les informations épigénétiques relatives à l'origine de la maladie. Reconnaître les signaux épigénétiques portés par l'ADNc en temps opportun revêt une importance capitale pour le dépistage précoce des maladies.

Dans ce contexte, l'extraction d'informations épigénétiques méthylées constitue un élément clé de la recherche liée à l'ADNcf. La capacité à discerner et à comprendre les informations épigénétiques intégrées dans l'ADNcf pourrait s'avérer déterminante pour faire progresser les méthodes de détection précoce des maladies.

Séquençage de méthylation basé sur le bisulfite

La signification biologique de la méthylation de l'ADN a été largement explorée à travers l'analyse du séquençage de la méthylation du génome entier ou simplifié. Cependant, ces méthodes présentent des limites lorsqu'il s'agit d'étudier efficacement les nombreux éléments régulateurs non codants au sein du génome des mammifères. Bien que le séquençage bisulfite du génome entier (WGBS) offre une couverture complète, il est à la fois coûteux et relativement inefficace. D'autre part, Séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS) cible des régions enrichies en CpG mais manque de couverture des sous-régions des enhancers et des sites de liaison CTCF au-delà des îles CpG.

Pour remédier à ces limitations, les chercheurs ont introduit une nouvelle approche de séquençage de méthylation connue sous le nom de séquençage bisulfite à représentation réduite de cfADN (cfDNA-RRBS). Cette méthode améliore la couverture des promoteurs, des enhancers et des sites de liaison CTCF, offrant de meilleures perspectives sur le paysage régulatoire. Notamment, le cfDNA-RRBS est compatible avec de faibles tailles d'échantillons et est applicable à l'analyse de cellules uniques.

Avantages de cfDNA-RRBS

• Englobant un spectre plus large d'éléments régulateurs de gènes, le cfDNA-RRBS se distingue par une efficacité accrue et des exigences de profondeur de séquençage réduites.
• Il est compétent pour discerner les variations de méthylation de l'ADN à travers divers types de cellules.
• Faciliter la prédiction de l'état des éléments fonctionnels, cfDNA-RRBS améliore notre compréhension des dynamiques réglementaires.
• Son applicabilité s'étend aux études de méthylation de l'ADN à cellule unique, élargissant ainsi le champ des possibilités d'investigation.

Le flux de travail du cfDNA-RRBS

• Extraction et Détection de l'ADN

L'extraction d'ADN à partir de tissus ou de cellules a été suivie d'un contrôle de qualité rigoureux, impliquant une électrophorèse sur gel d'agarose pour évaluer l'intégrité de l'ADN des échantillons et détecter la dégradation. La quantité totale d'ADN a été quantifiée à l'aide d'un fluoromètre Qubit.

• Construction de bibliothèques et évaluation de la qualité

(1) Construction de bibliothèque

Après des contrôles de qualité réussis, 5 à 10 ng d'ADN génomique ont été digérés avec l'enzyme Msp I à 37°C pendant 3 heures. L'ADN purifié résultant a été ligaturé avec la ligase T4 pour former des jonctions synthétiques de 5'-méthylcytosine. Le traitement par bisulfite ultérieur a converti les cytosines non méthylées en uraciles. La bibliothèque finale a été obtenue après amplification via des amorces hexamères aléatoires et PCR.

(2) Contrôle de la qualité des bibliothèques

Après la construction de la bibliothèque, une quantification préliminaire a été réalisée, avec une dilution de la bibliothèque à 1 ng/μl. Le système Agilent 2100 a évalué la taille des inserts, s'assurant qu'elle répondait aux attentes. Les bibliothèques avec des tailles d'inserts satisfaisantes ont été quantifiées avec précision (concentration effective >2 nM) à l'aide de la qPCR pour garantir la qualité.

• Séquençage

Après avoir réussi l'inspection de la bibliothèque, diverses bibliothèques ont été regroupées en fonction de la concentration effective et de la quantité de données requise pour la machine en aval cible. Par la suite, Séquençage Illumina a été réalisé.

Contrôle de qualité pour cfDNA-RRBS

• Contrôle de la qualité des données de séquençage

Les données brutes en aval englobent les séquences de jonction introduites lors de la construction de la bibliothèque et les bases de faible qualité, nécessitant une filtration pour les éliminer. Cette étape est cruciale car elle augmente le nombre de lectures alignées au génome, maximisant ainsi la récupération d'informations. Les amorces aléatoires sont excisées de cfDNA-RRBS bibliothèques en raison de leur structure spécifique.

• Évaluation de la qualité des données

Après la filtration des données brutes, une évaluation des taux d'erreur de séquençage et un examen de la distribution du contenu en GC sont effectués.

• Évaluation comparative de la qualité
• Après le contrôle qualité, les lectures subissent une comparaison avec un génome de référence basée sur la similarité des séquences. Des défis distincts se posent dans la comparaison de données cfDNA-RRBS comparé au séquençage traditionnel du génome et du transcriptome.
• Brins non complémentaires : Après la conversion au bisulfite, les brins d'ADN positifs et négatifs cessent d'être complémentaires, ce qui entraîne quatre séquences différentes après la PCR. Cela augmente l'effort de calcul pour la comparaison.
• Composition de séquence altérée : La conversion par bisulfite transforme la plupart des bases C en T, entraînant une séquence avec une forte teneur en T et une faible teneur en C. La PCR génère un brin complémentaire avec une forte teneur en A et une faible teneur en G, réduisant la complexité de la séquence et rendant la comparaison plus difficile.
• Contraste asymétrique entre C et T : Après transformation par bisulfite, les bases C déméthylées (prépondérantes dans la séquence) sont converties en T. Cela crée des discordances entre la séquence séquencée et le génome de référence, compliquant l'alignement.