Analyse de Segregation en Masse et ses Avancées : Techniques, Applications et Études de Cas

Concepts fondamentaux de la BSA

Analyse de ségrégation en vrac (BSA) une approche instrumentale dans la recherche génétique, désignée par l'acronyme BSA. Cette méthodologie consiste à construire une famille à partir de deux organismes parents présentant des traits cibles différenciés. Au sein de la population de descendants segregants, des individus présentant le trait souhaité sont sélectionnés pour former des échantillons d'ADN groupés. Ces échantillons groupés subissent séquençage à haut débit pour la préparation de la bibliothèque et le séquençage. Ce processus facilite le développement de marqueurs moléculaires de polymorphisme nucléotidique unitaire (SNP) et d'insertion/suppression (InDel) à l'échelle du génome.

En calculant les fréquences génotypiques des SNPs et des InDels, les chercheurs peuvent identifier des loci et des gènes associés au caractère cible à travers le génome. Par la suite, les gènes candidats subissent une annotation fonctionnelle pour mieux élucider les mécanismes génétiques et moléculaires régissant le caractère d'intérêt.

Concepts de base du BSA.

Stratégies expérimentales et de séquençage BSA

L'analyse par ségrégation en vrac implique un séquençage approfondi d'individus extrêmes regroupés provenant de populations en ségrégation pour localiser des intervalles génomiques candidats. Cette méthode est particulièrement efficace pour les espèces ayant des génomes de référence de taille petite à moyenne. Si vous souhaitez en savoir plus sur le flux de travail de l'ABV, vous pouvez consulter l'article "Flux de travail de la technologie BSA-seq.

La séquençage d'ARN par segregation en vrac (BSR) intègre l'analyse de sélection basée sur le phénotype (BSA) avec Séquençage de l'ARN (RNA-seq) pour une analyse complète. Dans le BSR, l'ARN total est extrait séparément de deux pools d'individus présentant des traits extrêmes dans la population en segregation, suivi d'un séquençage de l'ARN. Étant donné que les gènes ne constituent que 1 à 3 % du génome, le BSR est plus adapté aux espèces ayant de grands génomes, comme le blé.

Diagramme de flux BSA.

Flux de travail expérimental BSR

1. Sélection des traits et construction de la population

• Semblable à la BSA, des individus présentant des traits extrêmes sont sélectionnés pour constituer la population segregante.

2. Extraction d'ARN et construction de pools

• L'ARN total est extrait d'individus présentant des traits extrêmes, formant deux pools d'ARN distincts.

Séquençage RNA-seq

• Le séquençage à haut débit est effectué sur les pools d'ARN, avec une profondeur de séquençage déterminée par la taille du pool et la taille du génome de l'organisme.

4. Analyse de données

• Analyse du transcriptomeDéveloppe des marqueurs SNP en utilisant des données RNA-seq en conjonction avec l'analyse de sélection basée sur le phénotype (BSA) pour la localisation.
• Analyse d'expression différentielle: Utilise des outils tels que edgeR pour identifier les gènes associés aux traits cibles.

Applications de BSA et BSR

1. Applications de la BSA

• PortéeConvient aux espèces ayant des génomes de référence de petite à taille moyenne.
• AvantagesBSA offre un temps de cycle court, une localisation précise et un excellent rapport coût-efficacité, adaptable à toute population familiale présentant une ségrégation des traits.

2. Applications du BSR

• PortéeIdéal pour les espèces ayant des génomes plus grands, comme le blé.
• AvantagesEn intégrant la technologie RNA-seq, BSR fournit des données d'expression génique simultanées, améliorant la précision de localisation.

Comparaison de BSA et BSR

Recommandations

1. Construction de la populationSélectionnez des parents avec des différences de traits distinctes mais uniques et peu de sites hétérozygotes. Évitez les différences excessives pour minimiser les faux positifs, tandis que de légères différences peuvent entraîner une faible densité de marqueurs et entraver la localisation.

2. Protocole de séquençage:

• Pour les traits induits par EMS, il est recommandé de séquencer un parent sauvage et un pool de descendants mutants, ou un parent sauvage et deux pools de descendants.
• Pour les traits quantitatifs, il est conseillé de séquencer deux parents et deux pools de progéniture pour obtenir des résultats optimaux. L'implémentation de deux parents plus deux pools de progéniture donne les meilleurs résultats.

3. Construction de piscineExtraire l'ADN de chaque échantillon de progéniture indépendamment avant de regrouper des quantités égales pour éviter les erreurs systématiques.

Conclusion

BSA et BSR sont très efficaces. analyse génétique des méthodologies s'adressant à des organismes ayant des tailles de génome variées. Le BSA facilite la localisation des gènes liés aux traits cibles en utilisant des données ADN, tandis que le BSR intègre le RNA-seq pour améliorer la précision de localisation. Ces méthodes ont un potentiel immense dans la recherche agricole, en particulier dans l'amélioration des cultures et les programmes de sélection.

Techniques BSA et leurs variantes

Depuis sa création, l'Analyse de Segregation en Masse (BSA) a connu l'évolution et la diversification de ses algorithmes associés. Ces méthodologies sont adaptées à des matériaux de population génétique spécifiques et à des conceptions expérimentales. Les méthodes clés incluent l'approche Δ (indice SNP) pour les populations naturelles, la méthode MutMap pour les matériaux induits par EMS (Abe et al., 2012), et la méthode de Distance Euclidienne (ED) adaptée aux scénarios sans données parentales et avec seulement deux pools phénotypiques extrêmes (Hill et al., 2013). La méthode GradedPool-seq (GPS), conçue pour de grandes populations F2 et le regroupement basé sur le phénotype (plus de trois groupes) (Wang et al., 2019), ainsi que la méthode QTG-seq pour des conceptions génétiques plus complexes (Zhang et al., 2019) sont également notables. De plus, l'OcBSA, applicable aux populations F1 en segregation où les deux parents sont hautement hétérozygotes (Zhang, L. et al., 2024), a été développée. Au-delà de cela, l'algorithme de valeur G' (Magwene et al., 2011) offre une autre voie analytique basée sur des calculs mathématiques différents.

Analyse QTL

• Type de mutation applicable: Mutations naturelles
• Construction de la population: Croiser deux parents avec des différences phénotypiques significatives
• Sélection d'échantillons de séquençageDeux parents plus deux pools de progéniture

L'analyse des loci de traits quantitatifs (QTL) est une approche classique de cartographie génétique adaptée à la variation des traits induite par des mutations naturelles. Elle consiste à croiser deux parents avec des phénotypes distincts pour générer une population F2. Les individus aux phénotypes extrêmes de la population F2 sont regroupés pour un séquençage à haut débit. Les différences de fréquence des SNP entre les pools facilitent la localisation des régions QTL associées aux traits.

2. Analyse MutMap

• Type de mutation applicable: Mutations ponctuelles induites par des mutagènes tels que l'EMS
• Construction de la population: Croisement de mutants avec des parents de type sauvage suivi d'un retour en arrière
• Sélection d'échantillons de séquençageUn parent de type sauvage plus deux pools de progéniture ou un parent de type sauvage plus un pool de progéniture.

MutMap est utilisé pour cartographier les gènes mutants récessifs induits par la mutagenèse EMS. La méthode consiste à croiser le mutant avec un parent de type sauvage pour obtenir une descendance F1, suivie d'une autofécondation pour produire la génération F2. Des individus avec des phénotypes cohérents avec le mutant sont sélectionnés parmi la F2 pour un séquençage groupé. Les différences de fréquence SNP entre les mutants et les types sauvages permettent une cartographie rapide du gène mutant.

3. Méthode de distance euclidienne (DE)

• Type de mutation applicableDes espèces telles que les arbres forestiers hautement hétérozygotes, où la construction de la population F2 est difficile, ou des populations avec des informations parentales manquantes mais des différences phénotypiques.
• Construction de la populationPopulations de descendants croisés sans données parentales
• Sélection d'échantillons de séquençage: Deux pools de progéniture

La méthode de distance euclidienne convient aux espèces où les populations F2 sont difficiles à construire ou lorsque les informations parentales ne sont pas disponibles. En regroupant des individus de progéniture à phénotypes extrêmes et en réalisant un séquençage à haut débit, les chercheurs calculent la distance euclidienne entre les pools pour évaluer la force des associations marqueur-trait.

4. GradedPool-seq (GPS)

• Type de mutation applicableVariations des traits quantitatifs
• Construction de la population: Croiser deux parents avec des différences phénotypiques significatives
• Sélection d'échantillons de séquençage: 2-4 pools de descendants ou deux parents plus 2-4 pools de descendants

GPS construit des populations F2 basées sur le regroupement phénotypique, en utilisant la méthode Ridit pour comparer les différences SNP pour un cartographie à haute résolution. Cette méthode est particulièrement adaptée aux études de variation des traits quantitatifs et permet une localisation précise des régions de gènes associées aux traits.

Méthode de valeur G'

• Type de mutation applicableVariations des traits quantitatifs
• Construction de la population: Séparer des populations issues de croisements de parents présentant des différences phénotypiques substantielles.
• Sélection d'échantillons de séquençage: Deux pools de progéniture

La méthode de valeur G', basée sur un modèle de ségrégation génétique unitaire, est utilisée pour les études de variation des traits quantitatifs. En calculant la valeur G' à partir des données SNP dans des pools de progéniture, les chercheurs peuvent évaluer la force de l'association marqueur-trait, ce qui en fait un outil idéal pour les populations de ségrégation dérivées de croisements parentaux phénotypiquement divers.

6. QTG-seq

• Type de mutation applicableMutations de traits quantitatifs
• Construction de la population: BGFz>z populations
• Sélection d'échantillons de séquençage: Deux pools de progéniture

QTG-seq combine les données de transcriptome avec des techniques de BSA, adaptées à la recherche sur les mutations de traits quantitatifs. En construisant des populations BGFz>z et en réalisant un séquençage à haut débit des descendants, les chercheurs peuvent prédire des gènes candidats et explorer leurs fonctions.

Méthode OcBSA

• Type de mutation applicableMutations de traits quantitatifs
• Construction de la populationCette méthode est particulièrement efficace pour des espèces telles que les arbres forestiers qui sont difficiles à développer en lignées consanguines. Elle utilise une population F1 dérivée de deux parents hétérozygotes présentant des différences phénotypiques significatives.
• Sélection d'échantillons de séquençageL'analyse nécessite le séquençage des deux lignées parentales hétérozygotes ainsi que de deux pools de progéniture.

L'approche OcBSA est conçue pour s'adapter aux défis génétiques uniques posés par les espèces ayant des systèmes de reproduction complexes, facilitant ainsi l'identification et la cartographie des loci de caractères quantitatifs.

Étude de cas sur la BSA

TitreCsUFO est impliqué dans la formation de fleurs et de vrilles chez le concombre.

JournalGénétique théorique et appliquée

Résumé

Cette étude examine un mutant de concombre qui présente des phénotypes floraux et de vrilles inhabituels en raison d'une mutation dans un gène codant une protéine F-box. Les fleurs et les vrilles sont des traits agronomiques clés étroitement liés au rendement.

Résultats de recherche

1. Caractérisation phénotypique et analyse génétique

Une analyse phénotypique détaillée est cruciale pour des études génétiques réussies. Le mutant uft présente des structures atypiques ressemblant à des feuilles à la position des pétales de fleurs mâles (Figure 1). Les fleurs typiques possèdent cinq sépales et cinq lobes de pétales (Figure 1-A2), tandis que les fleurs du mutant uft affichent jusqu'à 13 structures reproductives, y compris des sépales et des organes en forme de feuille (Figure 1-B2). De plus, les étamines et les pistils du mutant uft montrent un mauvais co-développement (Figures 1-B5, B6), et il y a un développement aberrant des sépales, des pétales et des primordia d'étamines des fleurs mâles (Figure 1-B7). Au-delà des anomalies florales, les fleurs femelles du mutant uft développent des structures en forme de feuille sur le pédicelle (Figure 1-B4). Dans les mutants, les vrilles présentent également des anomalies, avec leurs extrémités remplacées par des structures en forme de feuille (Figure 1-B3).

Figure 1Comparaison phénotypique entre le type sauvage (A) et le mutant uft (B). (Chen, Y.) et al.., 2021)

2. Cartographie fine

En employant une stratégie duale de clonage basé sur la carte et d'analyse de la ségrégation des caractères, l'étude a utilisé 163 individus F2 et neuf marqueurs polymorphes pour cartographier préliminairement la mutation dans une région de 20,0 cM à 30,8 cM sur le chromosome 1 (~2,3 Mb). Le développement de nouveaux marqueurs et un mapping supplémentaire ont réduit la région à environ 124 kb, englobant 21 gènes candidats. Le séquençage à haut débit de l'ADN poolé de 30 individus de type sauvage et 30 individus phénotype uft, ainsi que du parent WD1, en utilisant la stratégie MutMap+, a identifié quatre SNP candidats dans l'intervalle. Le SNP6241389 a été identifié comme le marqueur significatif à travers une analyse supplémentaire.

Figure 2Résultats de cartographie fine de le uft mutation. (Chen, Y. et al.., 2021)

3. Fonction des gènes candidats, niveaux d'expression et localisation subcellulaire

La mutation entraîne un codon de terminaison prématuré, tronquant la protéine normale de 300 acides aminés au niveau du C-terminus. L'analyse phylogénétique, incorporant cinq séquences de protéines UFO et treize séquences supplémentaires de protéines MADS-box, souligne la conservation de UFO à travers les espèces au sein de la même famille. L'analyse qRT-PCR a révélé une forte expression de CsUFO dans les apex de pousses des types sauvages, avec une régulation à la baisse significative dans le mutant uft (Figure 3).

Figure 3: Structure, conservation et analyse d'expression du gène candidat CsUFO. (Chen, Y. et al.., 2021)

Si vous souhaitez en savoir plus sur les applications BSA, vous pouvez consulter l'article "Applications de l'analyse de ségrégation en vrac dans la recherche sur les plantes."

Conclusion

L'analyse de ségrégation en masse est une méthodologie établie qui consiste à analyser des échantillons d'ADN groupés provenant d'individus présentant des traits extrêmes au sein d'une population. En examinant les différences de fréquence allélique entre ces pools, les chercheurs peuvent efficacement cartographier les loci associés à des traits spécifiques à travers le génome. L'étendue de l'analyse de ségrégation en masse s'est considérablement élargie, étant appliquée à une gamme de plus en plus diversifiée d'espèces et entraînant un corpus de recherches publiées en pleine croissance. Elle est devenue un outil standard dans le domaine de la génétique moléculaire et de l'élevage.

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Références:

1. Magwene, Paul M., John H. Willis, et John K. Kelly. "Les statistiques de l'analyse de ségrégation en vrac utilisant le séquençage de nouvelle génération." PLoS biologie computationnelle 7.11 (2011) : e1002255. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des contenus externes, y compris des liens. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le copier ici et je serai heureux de vous aider.
2. Abe, A., Kosugi, S., Yoshida, K. et al.Le séquençage du génome révèle des loci d'importance agronomique chez le riz en utilisant MutMap. Nat Biotechnol 30, 174–178 (2012). Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
3. Hill, Camilla B., et al. "Cartographie du génome entier des traits agronomiques et métaboliques pour identifier de nouveaux loci de traits quantitatifs dans le blé tendre cultivé dans un environnement limité en eau." Physiologie des plantes 162,3 (2013) : 1266-1281. Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici.
4. Wang, C., Tang, S., Zhan, Q. et al.La dissection d'un gène hétérotique à travers le mapping GradedPool-Seq informe une stratégie d'amélioration du riz. Nat Commun dix, 2982 (2019). Désolé, je ne peux pas accéder à des liens externes.
5. Zhang, Hongwei, et al. "QTG-Seq accélère le cartographie fine des QTL grâce à la partition des QTL et au séquençage du génome entier d'échantillons de segregants en masse." Plante moléculaire 12.3 (2019) : 426-437. DOI : 10.1016/j.molp.2018.12.018
6. Zhang, Lingkui, et al. "OcBSA : Un outil d'analyse de ségrégation en vrac basé sur le NGS pour les populations de croisement." Plante moléculaire 17.4 (2024) : 648-657. DOI : 10.1016/j.molp.2024.02.011
7. Chen, Y., Wen, H., Pan, J. et al. CsUFO est impliqué dans la formation des fleurs et des vrilles chez le concombre. Théor Appl Génét 134, 2141–2150 (2021). Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.