Directives de préparation d'échantillons pour le séquençage à lecture longue

DIRECTIVES DE SOUMISSION D'ÉCHANTILLONS D'ADN

Lignes cellulaires

Collectez des cellules en culture avec paroi ou des cellules en suspension, retirez le milieu de culture ; lavez avec du PBS 1 à 2 fois rapidement, éliminez le PBS par centrifugation à basse vitesse ; transférez les cellules dans des tubes EP de 1,5 ml sans enzyme, centrifugez pour retirer le surnageant et placez dans de l'azote liquide ou un réfrigérateur à -80 °C pour un congélation rapide et transportez sur de la glace sèche.

Remarque : ≥5×10⁷ cellules sont requises par bibliothèque. Le rendement en ADN varie selon les types cellulaires. En général, le rendement en ADN des cellules plus grandes est légèrement inférieur, comme les myofibroblastes et les neurofibroblastes, et le volume cellulaire peut être augmenté de manière appropriée.

Blood

Des échantillons de sang total frais sont collectés directement à l'aide de tubes de collecte de sang anticoagulé à l'EDTA, mélangés 10 fois par inversions douces, puis placés dans de l'azote liquide ou un réfrigérateur à -80 °C et expédiés sur de la glace sèche après avoir été anticoagulés.

Remarque :

• Sang nucléé érythrocytaire : ≥500 μl de sang total par bibliothèque.
• Sang non nucléé érythrocytaire : ≥1,5 ml de sang total par bibliothèque.
• Le rendement en ADN varie considérablement entre les espèces et les individus, les érythrocytes des oiseaux ou des poissons contenant des noyaux et un rendement en ADN légèrement supérieur, tandis que les érythrocytes du sang humain et des mammifères n'ont pas de noyaux et ont un rendement en ADN inférieur, donc le volume d'échantillon doit être augmenté en conséquence.

Tissus animaux

1. Des tissus frais prélevés sur des organismes vivants (ou dans les 10 minutes suivant la mort de l'organisme) ont été sélectionnés et rincés avec une solution saline ou du PBS pré-refroidis dès que possible après le prélèvement pour éliminer les taches de sang et la saleté.
2. Les tissus conjonctifs et adipeux et d'autres types de tissus non requis pour l'étude ont été rapidement retirés sur glace, et les échantillons ont été divisés en petits morceaux d'environ 30-50 mg (la taille d'un grain de haricot vert, plus le tissu est petit, meilleur est l'effet de conservation).
3. Séchés par tamponnement et placés dans des tubes EP de 1,5 / 2,0 ml sans enzyme ou des tubes de centrifugeuse.
4. Placés dans de l'azote liquide ou un réfrigérateur à -80 °C après congélation rapide et transportés sur de la glace sèche.
5. Remarque :

• Chaque bibliothèque nécessite ≥1,5 g de tissu animal.
• Le rendement en ADN varie considérablement entre les différents types de tissus, par exemple, le rendement en ADN est plus élevé pour les tissus hépatiques métaboliquement actifs et plus faible pour les tissus musculaires, ce qui n'est pas recommandé.
• Des échantillons de sang ou de foie sont recommandés pour les poissons et la volaille.

Échantillons de plantes

Il est recommandé d'utiliser des échantillons de tissus frais, qui doivent être rincés avec de l'éthanol à 70 % ou de l'eau stérile, séchés par tamponnement, placés dans de l'azote liquide ou un réfrigérateur à -80 °C, puis placés dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml pré-refroidis ou enveloppés dans du papier aluminium et placés dans des sacs auto-scellants et expédiés sur de la glace sèche. Plus de 2 g par bibliothèque sont requis.

Microalgues

Des algues fraîches sont collectées, transférées dans des tubes EP de 1,5 ml sans enzyme, lavées une fois avec une solution de 0,3 M EDTA ou de l'éthanol à 70 %, le surnageant est retiré, congelées rapidement dans de l'azote liquide ou un réfrigérateur à -80 °C, et expédiées sur de la glace sèche. Plus de 2 g par bibliothèque sont requis.

Échantillons microbiens

Les bactéries, y compris les champignons, les actinomycètes et les bactéries, doivent être collectées à partir des stades de croissance logarithmique, retirées du milieu de culture et d'autres impuretés, transférées dans des tubes EP de 1,5 ml sans enzymes, congelées rapidement dans de l'azote liquide ou un réfrigérateur à -80 °C, et transportées sur de la glace sèche. Plus de 2 g par bibliothèque sont requis.

DIRECTIVES DE SOUMISSION D'ÉCHANTILLONS D'ARN

Lignes cellulaires

Collectez des cellules en suspension ou avec paroi dans des tubes EP / tubes de centrifugeuse sans enzyme et retirez le surnageant par centrifugation à basse vitesse. 1 × 10⁵-10⁷ cellules plus 1 ml de réactif TRIzol, lyse par soufflage répété pour éviter l'agglomération, incubez à température ambiante pendant 5-10 min pour lyser complètement en homogénat, puis congelez à -80 °C et transportez sur de la glace sèche.

Blood

1. Il est recommandé d'isoler et de livrer le sang total à l'aide de tubes spécialisés pour l'ARN sanguin, qui contiennent des réactifs spécifiques pour la fixation de l'ARN qui protègent les molécules d'ARN de la dégradation par les enzymes de l'ARN et minimisent l'altération des changements in vivo dans l'expression génique.

2. Du sang frais est collecté à l'aide de tubes pour l'ARN sanguin contenant 2,5 ml de sang par tube (a, sang nucléé érythrocytaire : ≥2,5 ml de sang total par bibliothèque ; b, sang non nucléé érythrocytaire : ≥5 ml de sang total par bibliothèque).

3. Mélangé doucement par inversions 8-10 fois immédiatement après la collecte.

4. Placé debout à température ambiante pendant 2 - 72 heures et transporté sur de la glace sèche.

5. Après 2 - 72 heures, transportez sur de la glace sèche.

Tissus animaux

1. Les tissus prélevés in vivo sont rincés avec une solution saline ou du PBS sans RNase pour éliminer les taches de sang et la saleté, et les échantillons sont divisés en petits morceaux d'environ 30-50 mg, immergés dans de l'azote liquide pour une congélation rapide, placés dans des tubes EP ou des tubes de centrifugeuse sans enzyme après congélation complète, stockés dans de l'azote liquide ou à -80 °C, et transportés sur de la glace sèche.

2. Si une solution de lyse TRIzol est utilisée pour préserver les échantillons envoyés, d'abord, l'azote liquide est broyé en poudre, puis le TRIzol est ajouté pour la lyse, la posologie de référence est de 50-100 mg/ml de TRIzol, après 5 minutes de lyse à température ambiante, -80 °C pour la congélation et de la glace sèche pour le transport.

3. Si RNAlater est utilisé, suivez les instructions de RNAlater. Gardez la taille du bloc de tissu à 5 mm, trop petit n'est pas propice à la collecte d'échantillons, trop grand, la solution protectrice ne peut pas pénétrer uniformément dans le tissu.

Échantillons de plantes

Il est recommandé d'utiliser des échantillons de tissus frais. Après le prélèvement, le matériau doit être rapidement rincé avec de l'eau DEPC-H₂O sans RNase ou de l'éthanol à 75 % pour éliminer la poussière et la terre de la surface du matériau, séché par tamponnement, et divisé en petits morceaux d'environ 50-100 mg, congelés rapidement dans de l'azote liquide, placés dans des tubes EP ou des tubes de centrifugeuse sans RNase, environ 500 mg par tube, congelés à -80 °C, et transportés sur de la glace sèche. Plus de 3-4 g de tissu végétal frais sont requis par bibliothèque.

Microalgues

Après avoir collecté des algues fraîches, transférez-les dans des tubes EP de 1,5 ml sans enzyme et lavez une fois avec une solution de 0,3 M EDTA sans RNase ou de l'éthanol à 70 % pour éliminer le surnageant. Chaque bibliothèque nécessite ≥3 g d'algues.

Échantillons microbiens

Champignon sur milieu solide, scellé par un film de scellage et transporté à température ambiante. Pour les champignons cultivés en milieu liquide, centrifugez le champignon dans des tubes de centrifugeuse et congelez immédiatement dans de l'azote liquide, conservez à -80 °C et transportez sur de la glace sèche. Environ deux volumes de plaque de 90 mm / 50 ml de corps fongiques fraîchement cultivés sont requis par bibliothèque.