Directives de Soumission d'Échantillons
Les avantages et le flux de travail de ChIP-seq
Qu'est-ce que le ChIP-seq ?
ChIP-seq (également connu sous le nom de ChIP-seq), qui combine des essais d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) avec Séquençage de l'ADN, est une technique puissante pour le profilage à l'échelle du génome des protéines liant l'ADN, des modifications des histones ou des nucléosomes. ChIP est un type de méthode expérimentale d'immunoprécipitation (IP) utilisée pour isoler des sites d'ADN spécifiques en interaction physique directe avec des facteurs de transcription et d'autres protéines. Dans ChIP, des anticorps spécifiques sont utilisés pour enrichir les fragments d'ADN liés par des protéines ou des nucléosomes particuliers.
ChIP-seq était l'une des premières applications de NGS (séquençage de nouvelle génération), et la première étude de profilage à grande échelle des méthylations des histones à l'échelle du génome utilisant ChIP-seq a été publié en 2007 (Barski et al., 2007). Le séquençage de cette étude a été réalisé sur la plateforme de l'analyseur de génome Solexa 1G. La même année, Johnson et al. (2007) ont utilisé ChIP-seq pour générer la cartographie à l'échelle du génome des sites de liaison des facteurs de transcription. Robertson et al. (2007) ont développé ChIP-seq pour identifier les séquences d'ADN mammalien liées par des facteurs de transcription in vivo. Ces deux articles ont également démontré l'augmentation de la sensibilité et de la spécificité de ChIP-seqEn raison des progrès rapides de technologie NGS et la diminution du coût du séquençage, ChIP-seq est devenu un outil indispensable pour la caractérisation des épigénomes et l'étude de la régulation des gènes (Park, 2009).
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Différence entre ChIp-chip et ChIp-seq
ChIP-chip, ChIP couplé avec des microarrays, et ChIP-seq sont deux techniques standard pour l'identification des interactions ADN-protéines à l'échelle du génome. Tirant parti des technologies de séquençage, ChIP-seq offre de nombreux avantages par rapport au ChIP-chip, comme résumé dans le Tableau 1 (Park, 2009 ; Schones et Zhao, 2008).
Tableau 1. Comparaison entre ChIP-chip et ChIP-seq.
| ChIP-chip | ChIP-seq | |
| Résolution maximale | Spécifique au tableau, généralement 30-100 pb | Nucleotide unique |
| Couverture | Limité par des séquences sur le tableau ; les régions répétitives sont généralement masquées. | Limité uniquement par l'alignabilité des lectures au génome ; augmente avec la longueur des lectures ; de nombreuses régions répétitives peuvent être couvertes. |
| Flexibilité | Dépendant des produits disponibles ; plusieurs tableaux peuvent être nécessaires pour de grands génomes. | Essai à l'échelle du génome de tout organisme séquencé |
| Source de bruit de la plateforme | Hybridation croisée entre des sondes et des cibles non spécifiques | Il peut y avoir un certain biais GC. |
| Conception expérimentale | Canal simple ou double, selon la plateforme. | Canal unique |
| Étuis économiques | Profilage de régions sélectionnées ; lorsque une grande fraction du génome est enrichie pour la modification ou la protéine d'intérêt (liaison large) | Génomes larges ; lorsque une petite fraction du génome est enrichie pour la modification ou la protéine d'intérêt (liaison précise) |
| Quantité requise d'ADN ChIP | Élevé (quelques microgrammes) | Faible (10-50 ng) |
| Plage dynamique | Limite de détection inférieure ; saturation à fort signal | Pas limité |
| Amplification | Plus requis | Moins de matériel requis ; le séquençage de molécules uniques sans amplification est disponible. |
| Multiplexage | Pas possible | Possible |
Comment fonctionne le ChIP-seq ?
Le flux de travail de ChIP-seq utilisé pour profiler les sites de liaison spécifiques de l'ADN pour les facteurs de transcription, les enzymes liant l'ADN ou d'autres protéines associées à l'ADN (ChIP non-histone) et les sites d'ADN correspondant à des nucléosomes modifiés (ChIP histone) est illustré dans la Figure 1 (Park, 2009). Après les protocoles ChIP, la chromatine est fragmentée et les protéines ou nucléosomes modifiés liés par des liaisons croisées sont immunoprécipités à l'aide d'un anticorps spécifique à la protéine ou à la modification de l'histone. Après purification de l'ADN et construction de la bibliothèque, les fragments d'ADN peuvent être séquencés simultanément sur n'importe quelle plateforme de séquençage, telles que l'Illumina Solexa Genome Analyzer, Roche 454 et les plateformes SOLiD d'Applied Biosystems (ABI), ainsi que HeliScope de Helicos, comme illustré dans la Figure 1. Avec les progrès énormes de technologie NGSLa plateforme Illumina, comme Hiseq, a été la plateforme de séquençage la plus largement utilisée.
Figure 1. Aperçu d'une expérience ChIP-seq (Park, 2009).
Conception expérimentale du ChIP-seq
L'Encyclopédie des éléments d'ADN (ENCODE) et le consortium des organismes modèles ENCODE (modENCODE) ont élaboré un ensemble de normes et de directives de travail pour ChIP-seq expériences basées sur l'expérience de centaines de ChIP-seq expériences (Landt et al., 2012). Pour obtenir des données ChIP-seq de haute qualité, plusieurs aspects techniques doivent être pris en compte dans le ChIP-seq conception expérimentale, y compris les anticorps, le nombre de cellules, les contrôles, les réplicats, la fragmentation de la chromatine, la construction de la bibliothèque et le séquençage (Kidder et al., 2011).
Anticorps
La qualité des anticorps utilisés pour le ChIP est l'un des facteurs les plus importants qui contribuent à la qualité de ChIP-seq données.
Un anticorps sensible et spécifique donnera un niveau élevé d'enrichissement. L'efficacité limitée de l'anticorps est la principale raison des échecs. ChIP-seq expériences.
La validation et la caractérisation des anticorps doivent être effectuées avant le début de la ChIP.
Numéro de portable
Comme le rapport signal sur bruit (SNR) est directement corrélé au nombre de cellules, utiliser le bon nombre de cellules peut aider à diminuer le bruit de fond.
L'abondance de la protéine ou de la modification des histones à étudier et la qualité de l'anticorps doivent être prises en compte lors de la détermination du nombre de cellules.
Contrôles
Une partie importante de ChIP-seq La conception expérimentale consiste à déterminer quels contrôles utiliser. Un ChIP-seq le pic doit être comparé avec la même région dans un contrôle apparié.
Il existe plusieurs types de contrôles différents, mais aucun consensus sur lequel est le plus approprié :
ADN d'entrée.
IP simulé : ADN obtenu à partir de l'IP sans anticorps.
IP non spécifique : utilisation d'un anticorps contre une protéine dont on ne sait pas qu'elle est impliquée dans la liaison à l'ADN.
Répliques
De haute qualité ChIP-seq Les ensembles de données sont des ressources précieuses pour la communauté. De nombreux facteurs, y compris les conditions de culture cellulaire, le ChIP et la construction de bibliothèques, peuvent contribuer à la variabilité entre les ensembles de données.
Pour garantir la fiabilité des données, des expériences de réplicats biologiques sont nécessaires.
Fragmentation de la chromatine
Avant la ChIP, la chromatine doit être fragmentée en une taille gérable.
ChIP-seq pour les protéines liant l'ADN, utilise la digestion par endonucléase ou la sonication pour fragmenter l'ADN.
ChIP-seq pour les modifications des histones, utilise la digestion par la micrococcale nucléase (MNase) pour fragmenter l'ADN.
Construction de bibliothèque et séquençage
Les bibliothèques peuvent être construites à partir de l'ADN ChIP selon des protocoles standards spécifiques à la plateforme de séquençage.
Le processus de construction de la bibliothèque et de séquençage, y compris la sélection de taille, la purification par gel, la PCR, la stratégie de séquençage en simple ou en double extrémité et la profondeur de séquençage, affecterait le ChIP-seq qualité des données.
En tenant compte des aspects techniques mentionnés ci-dessus, un ChIP-seq un séquençage sur NGS plateformes.
Figure 2. Conception expérimentale de ChIP-seq (Kidder et al., 2011).
Chez CD Genomics, nous vous offrons des services de séquençage de haute qualité et intégrés. bioinformatique analyse pour vous ChIP-Seq projet, permettant de dépister avec précision et de déterminer les sites de liaison des protéines dans l'ensemble du génome. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.
Lecture complémentaire :
Pipeline et outils pour l'analyse ChIP-seq
Références :
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y., Schones, D.E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., et Zhao, K. (2007). Profilage haute résolution des méthylations des histones dans le génome humain. Cellule 129, 823-837.
- Johnson, D.S., Mortazavi, A., Myers, R.M., et Wold, B. (2007). Cartographie à l'échelle du génome des interactions in vivo entre protéines et ADN. Science 316, 1497-1502.
- Kidder, B.L., Hu, G., et Zhao, K. (2011). ChIP-Seq : considérations techniques pour obtenir des données de haute qualité. Immunologie de la nature 12, 918-922.
- Landt, S.G., Marinov, G.K., Kundaje, A., Kheradpour, P., Pauli, F., Batzoglou, S., Bernstein, B.E., Bickel, P., Brown, J.B., Cayting, P., et al. (2012). Directives et pratiques de ChIP-seq des consortiums ENCODE et modENCODE. Recherche génomique 22, 1813-1831.
- Park, P.J. (2009). ChIP-seq : avantages et défis d'une technologie en maturation. Nature Reviews Genetics 10, 669-680.
- Robertson, G., Hirst, M., Bainbridge, M., Bilenky, M., Zhao, Y., Zeng, T., Euskirchen, G., Bernier, B., Varhol, R., Delaney, A., et al. (2007). Profils génomiques de l'association de l'ADN de STAT1 utilisant l'immunoprécipitation de la chromatine et le séquençage parallèle massif. Méthodes de la nature 4, 651-657.
- Schones, D.E., et Zhao, K. (2008). Approches à l'échelle du génome pour l'étude des modifications de la chromatine. Revue de la nature Génétique 9, 179-191.
