Questions et réponses sur le profilage des ribosomes

Séquençage des ribosomes peut obtenir des informations précises et une quantification exacte de toutes les molécules traduisibles (y compris l'ARNm et d'autres molécules d'ARN potentiellement traduisibles telles que l'lncRNA, l'ARN circ, etc.) dans un échantillon, et constitue un pont entre le transcriptome et le protéome.

L'ARN-Seq peut refléter le type et la quantité d'ARNm dans les cellules, et peut également détecter des variations de séquence et un épissage variable de l'ARNm. Cependant, il ne reflète pas si l'ARNm est traduit en la protéine correspondante et le niveau de traduction. L'analyse du translatome peut étudier le niveau, la région et le taux de traduction des gènes dans les cellules, etc.Combinaison transcriptome, séquençage de petits ARNet le protéome pour l'analyse de corrélation, nous pouvons étudier plus précisément la régulation post-transcriptionnelle et le mécanisme de régulation de la traduction.

Les taux de capture de traduction peuvent révéler quels gènes sont exprimés, en quelles quantités et quand ils sont nécessaires. Le profilage des ribosomes permet une surveillance à l'échelle du génome de la synthèse protéique en cours et complète d'autres approches globales (par exemple, le séquençage de l'ARN). En fait, le séquençage des ribosomes a été utilisé pour étudier le mécanisme d'action des antibiotiques phénotypiques chez les bactéries, les mécanismes de régulation chez les plantes et les animaux en situation de stress, les mécanismes moléculaires du vieillissement développemental chez les individus, et les mécanismes de développement des tumeurs, entre autres. Si vous avez un projet qui nécessite une consultation, vous pouvez contact nos experts techniques.

La méthode de poly-A tailing sacrifie le rendement pour garantir l'exactitude de l'extrémité 5' de la bibliothèque, ce qui est crucial pour une bonne périodicité des triplets. Le taux de rendement interne (IFR) basé sur cette méthode est d'environ 50-60 %.
La méthode de ligation d'adaptateurs obtient un rendement élevé ; cependant, la précision de l'extrémité 5' de la bibliothèque est faible. Environ 30 % des lectures dont les premiers nucléotides ne peuvent pas être alignés au génome, probablement en raison de l'ajout non template lors de la transcription inverse. Ainsi, il est nécessaire de retirer le premier nucléotide de désaccord de l'extrémité 5' pour obtenir un P-site précis.

L'inhibiteur de la synthèse des protéines cycloheximide (CHX) est largement utilisé dans les expériences de Ribo-seq. Des études récentes ont révélé que le CHX peut entraîner une régulation transcriptionnelle à la hausse des gènes impliqués dans la production de ribosomes, ce qui entraîne une diminution significative de l'efficacité de la traduction. En plus de l'effet sur la transcription, la concentration de CHX utilisée affecte également la distribution des "empreintes" ribosomiques sur l'ARNm, des concentrations faibles de CHX provoquant un biais artificiel qui peut être évité en augmentant les concentrations de CHX.

L'utilisation de ribonucléase (RNase) pour digérer les parties d'ARNm situées à l'extérieur du ribosome est une étape importante dans le séquençage des ribosomes. Par conséquent, le choix de la RNase et la concentration utilisée sont cruciaux.
Actuellement, l'ARNase I est la plus couramment utilisée. Le plus grand avantage de l'ARNase I par rapport aux autres est qu'elle n'a pas de préférence pour la coupure des bases. Cependant, pour certaines espèces (par exemple, l'humain), l'efficacité d'obtention des ribosomes 80S avec l'ARNase I est faible, et il est difficile d'obtenir les ribosomes 80S souhaités si la quantité d'ARNase I n'est pas bien contrôlée, comme le montre le fait que si la concentration d'ARNase I est trop élevée, l'intégrité des ribosomes sera gravement endommagée, rendant la bibliothèque finale contenant une grande quantité d'ARN ribosomal (ARNr). Si la concentration d'ARNase I est trop basse, bien que certaines intégrités ribosomiques puissent être maintenues, cela rendra les fragments d'ARNm protégés par les ribosomes incomplètement clivés. Par conséquent, un pré-test est nécessaire pour déterminer la ribonucléase à utiliser et la concentration de travail de la ribonucléase.

• Pour les échantillons cellulaires, la taille d'échantillon recommandée est ≥1×10⁶.
• Échantillons de tissus animaux, le volume de livraison d'échantillon recommandé ≥ 200 mg
• Échantillons de tissus végétaux, la taille d'échantillon recommandée est ≥400 mg
Les échantillons cellulaires doivent être prétraités avec de l'harringtonine et de la cycloheximide, puis envoyés congelés dans de l'azote liquide. Les échantillons de tissu sont collectés, rapidement congelés dans de l'azote liquide et expédiés sur de la glace carbonique.