Exigences d'échantillon pour le séquençage microbien

À mesure que les technologies de séquençage à haut débit progressent rapidement, notre compréhension du microbiote subit un raffinement continu. Le séquençage microbien s'étend sur une variété d'échantillons, allant des sols perchés au sommet de sommets imposants aux couches sédimentaires des abysses océaniques. Cette diversité permet d'explorer les impacts microbiens sur les fluctuations environnementales et de déchiffrer les énigmes physiologiques inhérentes à divers organismes. Pour obtenir des résultats de séquençage significatifs, le respect strict des procédures standardisées pour la collecte et la soumission des échantillons est primordial—une condition fondamentale pour le succès des initiatives de recherche.

Avant de soumettre des échantillons pour séquençage, il est crucial de prendre en compte les points suivants :

Stérilisation des outils et des contenants d'échantillonnage : Assurez-vous que les outils et les contenants utilisés pour l'échantillonnage ont subi une stérilisation appropriée.

Étiquetage et tenue de dossiers en temps opportun : Étiquetez immédiatement les échantillons après leur collecte et maintenez des dossiers détaillés des informations pertinentes sur l'échantillonnage.

Sauvegarde des Échantillons Avant Soumission : Créez des sauvegardes des échantillons avant la soumission pour vous protéger contre des circonstances imprévues pouvant entraîner la perte de spécimens précieux.

Utilisation de conteneurs standards pour la soumission d'échantillons : Utilisez des conteneurs standards pour soumettre des échantillons, en veillant à un étiquetage clair et précis. Évitez les quantités excessives d'échantillons lors de la soumission.

Maintenir des conditions de basse température pendant l'expédition : Pendant l'expédition, maintenez un environnement à basse température. Il est recommandé d'utiliser de la glace carbonique pour l'expédition.

L'attention portée à ces détails est essentielle pour garantir l'intégrité et l'analyse réussie des échantillons dans le contexte du séquençage microbien.

Pour différents types d'échantillons environnementaux, les méthodes de soumission d'échantillons recommandées sont les suivantes :

Échantillons environnementaux :

(1) Sol ou sédiment :

Collectez 5 à 10 g de sol, en enlevant les débris de surface.

Extraire le sol d'une profondeur de 5 à 10 cm, en combinant des échantillons provenant d'au moins trois points de collecte pour chaque spécimen.

Placez l'échantillon composite dans des tubes de centrifugeuse stériles.

Transportez les échantillons au laboratoire à des températures inférieures à 0 °C et conservez-les à -80 °C.

Pour les échantillons de sédiments avec une teneur en humidité plus élevée, collectez un minimum de 50 g.

Il est conseillé d'utiliser des conteneurs ne dépassant pas la taille de tube de centrifugeuse de 15 mL pour les échantillons de sol.

(2) Eau :

Utilisez des membranes filtrantes de 0,22 µm ou 0,45 µm pour la filtration.

Filtrer des volumes d'eau allant de 5 à 10 L, avec une surface de membrane filtrante optimale de 3 à 4 cm.

Conservez la membrane filtrante à -80°C.

Évitez l'expédition directe de conteneurs difficiles à ouvrir, tels que les porte-filtres, car cela pourrait compliquer la récupération des échantillons lors des expériences et impacter les délais du projet.

Pour les échantillons d'eau originaux, il est recommandé de les expédier dans des tubes de centrifugeuse de 50 mL. Si l'échantillon d'eau dépasse 50 mL, veuillez le filtrer vous-même et envoyer la membrane filtrante.

Échantillons de plantes :

(1) Microbiote de la rhizosphère :

Collectez le sol de rhizosphère à une profondeur de 20 cm et placez-le dans des tubes stériles de 50 mL.

Tamisez le sol à travers un tamis de 20 mailles pour enlever les racines de plantes, les restes d'animaux et d'autres impuretés.

Placez 3-5 g par tube, scellez immédiatement et congelez rapidement dans de l'azote liquide.

(2) Surface de la feuille :

Collectez 50 à 100 g de matériel végétal et rincez-le à l'eau stérile.

Après lavage, filtrez l'eau stérile à travers un filtre à membrane, en conservant la membrane filtrante à -80°C.

(3) Microbes endophytes :

Utilisez le PBS pour éliminer les bactéries de surface.

Coupez le tissu végétal, libérant des microbes endophytes.

Placez le matériau végétal dans l'eau avec des billes de verre et agitez.

Filtrer la suspension à travers une membrane filtrante de 5 µm.

Centrifugez le filtrat (15000 tr/min, 4°C) pour collecter le précipité microbien.

Collectez les microbes dans des cryotubes importés et conservez-les à -80°C.

En raison de la susceptibilité des microbes endophytes à la contamination par les cellules hôtes, les acides nucléiques extraits peuvent contenir une quantité significative d'ADN hôte. Des mesures précises doivent être prises pour traiter la contamination potentielle par l'hôte durant le processus d'extraction des acides nucléiques.

Échantillons fécaux et intestinaux :

(1) Échantillons fécaux humains :

Collectez environ 3 g (environ la taille d'un soja) de matière fécale.

Pour éviter toute contamination, il est recommandé de jeter l'urine et d'utiliser une cuillère stérile pour prélever des échantillons internes des selles.

(2) Échantillons de fèces de souris :

Collectez 0,5 g (3 billes) de matière fécale provenant de souris.

Placez les souris dans une cage propre tapissée de papier filtre désinfecté, et collectez les échantillons de fèces immédiatement après la défécation.

Utilisez du papier filtre frais pour chaque souris afin d'éviter la contamination croisée.

Après avoir collecté les échantillons, placez-les rapidement dans des cryotubes importés et congelez-les rapidement dans de l'azote liquide. Ensuite, conservez-les à -20°C, et pour un stockage à long terme, transférez-les à -80°C. Il est recommandé d'expédier les échantillons fécaux dans des tubes contenant une solution protectrice pour préserver l'intégrité des échantillons pendant le transport.

(3) Contenu intestinal : Pour la collecte de contenu intestinal :

Utilisez un scalpel chirurgical stérile pour réaliser une incision longitudinale le long du tractus digestif.

Récupérez le contenu du tractus digestif et placez-le dans des cryotubes importés.

Congeler immédiatement les échantillons dans de l'azote liquide et les conserver à -80°C.

Pour les animaux de grande ou moyenne taille tels que les bovins, les moutons, les gros rats et les lapins, collectez 200-1000 mg par échantillon. Pour les petits animaux comme les souris, collectez 200-500 mg par échantillon. Pour les animaux ayant des contenus intestinaux limités, tels que les poissons et les crevettes, collectez au moins 100 mg par tube.

Échantillons oraux

(1) Salive :

Utilisez un collecteur de salive désigné.

Instruisez la personne à expectorer de la salive dans le collecteur 2 à 3 fois (environ 1 mL par crachat).

Ajoutez un stabilisateur d'ADN à la salive collectée.

Transférez le mélange dans des cryotubes importés, congelez rapidement dans de l'azote liquide et soumettez pour analyse.

(2) Plaque dentaire :

Placez du fil dentaire entre les dents adjacentes pour collecter la plaque interdentaire.

Utilisez un coton-tige stérile pour prélever la plaque sur la surface occlusale des dents postérieures.

Après la collecte, placez les échantillons dans des tubes d'échantillonnage contenant une solution de préservation.

Agitez rapidement pendant 30 secondes, et les échantillons peuvent être expédiés à température ambiante.

Dispositif de collecte d'ADN à partir de la salive

Échantillons de tissu

(1) Muqueuse intestinale :

Sélectionnez des segments de différentes parties de l'intestin.

Incisez verticalement le segment intestinal opposé au mésentère pour exposer la lumière intestinale.

Utilisez un échantillonneur stérile pour prélever des échantillons du contenu intestinal, en les stockant séparément.

Après avoir nettoyé le contenu intestinal, rincez la lumière intestinale avec une solution saline stérile pour éliminer les contenus intestinaux visibles (afin d'éviter de perturber la muqueuse).

Grattez doucement la muqueuse intestinale avec une lame de verre stérile (en évitant de pénétrer dans la membrane basale).

La taille de l'échantillon doit être d'environ la taille d'un ongle (environ 0,8 cm * 0,8 cm).

Conservez les échantillons dans des cryotubes importés, en les congelant rapidement avec de l'azote liquide, et stockez-les à -80°C.

(2) Tumeur gastrique :

Utilisez des méthodes telles que la technique de fistule ruminale, l'insertion d'un tube gastrique par la bouche ou le nez, ou des méthodes de ponction pour collecter le contenu gastrique.

Après être passé à travers quatre couches de gaze stérile pour filtration, collectez le liquide gastrique et conservez-le à -80°C.

(3) Sang :

Essuyez le site de ponction veineuse avec de l'alcool à 70 % et attendez au moins 60 secondes.

Effectuer une ponction veineuse et prélever 2 mL de sang total dans un tube contenant un anticoagulant EDTA.

Inversez le tube anticoagulant 8 à 10 fois pour bien mélanger l'EDTA et le sang total, garantissant une anticoagulation efficace.

Conserver à -20°C.

(4) Peau :

Évitez de vous baigner 24 heures avant l'échantillonnage et évitez d'utiliser des hydratants ou des savons antibactériens.

Sélectionnez une zone d'environ 4 cm * 4 cm (environ la taille de six vignettes) pour l'échantillonnage.

Grattez doucement la surface de la peau en utilisant une lame chirurgicale stérile.

(5) Échantillons d'urine :

Collectez un échantillon d'urine matinale à jeun, avec ou sans hématurie.

Les femmes devraient éviter de faire un échantillonnage pendant leurs menstruations et prévenir la contamination de l'urine par des sécrétions vaginales.

Collectez une quantité appropriée d'urine intermédiaire aléatoire, de préférence 3 mL ou plus, et conservez-la par congélation rapide dans de l'azote liquide.

(6) Échantillons du tractus reproducteur :

Évitez les activités sexuelles pendant 48 heures et abstenez-vous de modifier la structure microbienne, comme le nettoyage de la zone intime ou l'utilisation de médicaments, pendant 30 jours.

Utilisez un écouvillon stérile pour prélever un échantillon adéquat, immergez-le dans 2 mL de solution PBS dans un cryotube importé, jetez l'écouvillon et congélez rapidement dans de l'azote liquide.

En raison de la difficulté à obtenir des échantillons de tissus, veillez à utiliser de la glace carbonique pour l'expédition lors de l'envoi d'échantillons de tissus.

Autres types d'échantillons :

(1) Microbiote de surface sur les objets :

Placez l'objet dans un conteneur stérile, ajoutez une quantité appropriée de PBS pour immerger l'objet.

Utilisez un équipement tel qu'un shaker pour faire tourner et secouer, déloger la microbiote de surface de l'objet.

Collectez l'échantillon d'eau, effectuez une centrifugation à haute vitesse à basse température et recueillez le précipité dans un cryotube importé.

Conserver à -80°C.

(2) Aliments fermentés :

Déterminez le volume d'échantillon en fonction des considérations de conception expérimentale.

En raison de la nature unique des aliments fermentés, l'échantillon doit être emballé dans un conteneur stérile et scellé.

Conserver à -80 °C.

Résumé :

Assurer des pratiques d'échantillonnage et de livraison standardisées est crucial pour maintenir la qualité des échantillons, garantissant finalement des résultats souhaitables lors des phases d'extraction, de construction de bibliothèque et d'analyse ultérieures.

Dans le domaine de la recherche microbiologique, CD Genomics propose des services complets englobant diversité microbienne, métagénomique, et séquençage métatranscriptomique analyses :

Diversité de la population : Principalement réalisée par le biais de Séquençage 16S/18S/ITSCette approche explore les types et l'abondance des communautés microbiennes au sein des échantillons. Elle facilite la comparaison des différences inter-échantillons et de leur signification au niveau de la population, offrant des aperçus sur les variations entre les échantillons.

Diversité Fonctionnelle : En s'appuyant sur le séquençage métagénomique ou métatranscriptomique, ce service explore les types de gènes, leur abondance et les différences d'expression au sein des échantillons. Il examine l'évolution des communautés microbiennes, les interactions microbiennes avec l'environnement et les relations entre microbes et hôtes, révélant et étudiant de nouveaux gènes fonctionnels.

Analyse Multi-Stratégies Intégrée : En combinant Séquençage 16S/18S/ITS, séquençage métagénomique, séquençage métatranscriptomique, et la métabolomique, une exploration complète est réalisée. Cela révèle non seulement les types microbiens et les structures de population, mais examine également en profondeur les liens entre fonction et expression génique. De plus, cela permet d'étudier les réponses microbiennes aux changements environnementaux au niveau métabolique.

Séquençage de micro-organismes uniques : Conçu pour les microbes cultivables, ce service utilise le séquençage du génome entier des bactéries ou le fine-mapping des champignons pour décoder les génomes des espèces, fournissant des informations sur les fonctionnalités associées à ces espèces.