Préparation de bibliothèque Illumina

La construction de bibliothèques implique la préparation de l'ARN ou de l'ADN cible pour être compatible avec les instruments de séquençage. Initialement, l'ADN ou l'ARN est extrait des tissus ou des cellules et fragmenté à l'aide de méthodes mécaniques ou enzymatiques. Dans le cas des échantillons d'ARN, une transcription inverse est réalisée pour convertir l'ARN en cDNA, suivie de la ligation des fragments d'ADN. Par la suite, la bibliothèque subit une amplification, généralement par PCR, pour amplifier les fragments cibles souhaités avant d'être prête pour le séquençage.

Pour la préparation de bibliothèques Illumina, le processus comprend souvent des étapes spécifiques adaptées à Séquençage Illumina plateformes. Cela peut impliquer la réparation des extrémités et l'ajout de bases dA pour faciliter la ligation d'adaptateurs ultérieurs. Les méthodes de construction de bibliothèques Illumina intègrent également des séquences d'adaptateurs uniques compatibles avec les séquenceurs Illumina. Les bibliothèques sont ensuite soumises à une amplification PCR pour enrichir les fragments cibles. En fin de compte, les bibliothèques Illumina sont préparées et optimisées pour produire des données de séquençage de haute qualité sur les plateformes Illumina.

Au cœur de la construction de bibliothèques se trouve le processus d'ajout de jonctions aux extrémités des fragments examinés. Actuellement, les méthodes de construction de bibliothèques d'ADN peuvent être classées en cinq catégories en fonction des différentes approches de connexion des jonctions.

Flux de travail de préparation de bibliothèque pour les plateformes Illumina

• Réparation de fin et dA Tailing

Après la fragmentation aléatoire de l'ADN à l'étape précédente, les fragments d'ADN générés peuvent avoir des extrémités inégales. Ainsi, cette étape se concentre sur la modification des extrémités de ces fragments d'ADN. Elle consiste à aplanir les extrémités et à ajouter une base A distinctive à l'extrémité 3', tout en phosphorylant l'extrémité 5'. L'objectif principal de l'ajout de la base A est de créer des extrémités collantes, facilitant l'attachement des amorces de jonction à l'étape suivante.

• Ligation d'adaptateurs

Un adaptateur sert de courte séquence de bases, reliant le fragment d'ADN examiné à la Flowcell. La ligase T4 est couramment utilisée pour réparer les incisions à brins simples dans l'ADN double brin, facilitant la reconnexion des nucléotides adjacents. Dans le cas de la ligation, un fragment d'ADN avec une extrémité collante "T" peut être lié à un autre fragment d'ADN avec une extrémité collante "A", formant un double brin complet.

Une fois la ligation TA effectuée, la liaison phosphodiester entre l'adaptateur et le fragment d'ADN est établie. En général, la réaction de ligation se déroule dans un tampon contenant des particules de sel à haute concentration et du PEG. Les particules de sel à haute concentration neutralisent la charge négative de l'ossature phosphate, facilitant l'agrégation des acides nucléiques, tandis que le PEG capture les molécules d'eau de l'ossature des acides nucléiques, favorisant l'agrégation des molécules d'acides nucléiques. De plus, le PEG augmente la viscosité de la solution, aidant à la sédimentation des billes de purification. Cependant, les billes magnétiques peuvent poser des défis en matière de sédimentation. Après la ligation, le produit nécessite une purification pour éviter toute interférence avec l'étape d'amplification PCR suivante.

Schéma de préparation de bibliothèque multiplex Illumina MiSeq utilisant des amorces PCR à queue et la ligation d'adaptateurs Y à index unique. (Bourlat et al., 2016)

• Amplification de bibliothèque

Préparation de bibliothèque d'amplicons Illumina par amplification PCR en 2 étapes. (Holm et al., 2018)

Comparaison des méthodes de préparation de bibliothèques Illumina : TruSeq ADN vs. Nextera

Illumina propose deux méthodes principales pour la préparation des bibliothèques : la méthode TruSeq DNA (construction de bibliothèque standard) et la méthode de construction de bibliothèque Nextera (méthode de transposase pour la construction de bibliothèque), chacune répondant à des besoins et des préférences distincts.

La méthode TruSeq DNA est reconnue pour sa complexité, mais elle offre plusieurs avantages. Avec un volume de départ de bibliothèque requis de 500 ng, elle s'adapte aux échantillons d'ADN de qualité inférieure, présentant une solution rentable avec une couverture génomique élevée. De plus, ses capacités d'automatisation rationalisent le processus, la rendant adaptée aux bibliothèques génomiques générales.

D'autre part, la méthode de construction de bibliothèque Nextera est prisée pour sa simplicité. Bien qu'elle exige une ADN de meilleure qualité, elle présente des avantages tels qu'une opération plus rapide et une flexibilité. Avec une exigence de volume de départ aussi basse que 50 ng, voire 1 ng, elle est particulièrement bien adaptée aux échantillons de volume limité. Cependant, elle a un coût plus élevé et peut entraîner une couverture génomique inférieure par rapport à la méthode TruSeq.

Construction de Bibliothèque Standard d'Illumina

La construction de bibliothèques standard d'Illumina implique principalement une interruption mécanique pour le dimensionnement des fragments, à l'exception de la construction d'amplicons. La procédure d'assemblage de la bibliothèque se déroule comme suit :

• Fragmentation de l'ADN par interruption ultrasonique.
• Réparation de fin, suivie de l'ajout de "A".
• Jonction de liaison.
• Dépistage de fragments.
• Enrichissement par PCR des fragments cibles, suivi du contrôle de qualité.
• Séquençage.

La méthode de transposase pour la construction de bibliothèques

La méthode de transposase pour la construction de bibliothèques utilise la transposase pour fragmenter le génome, et le processus se déroule comme suit :

La transposase fragmente l'ADN génomique, intégrant simultanément les adaptateurs requis directement aux extrémités des fragments, ce qui réduit le temps de construction de la bibliothèque et diminue les besoins en échantillons. Cette méthode est particulièrement adaptée aux applications avec une disponibilité limitée des échantillons, telles que les biopsies tumorales, l'ADN dégradé ou l'ADN purifié.

• Attachement des jonctions aux fragments interrompus par la transposase.
• Purification des fragments d'ADN de bibliothèque (élimination de la transposase).
• Plusieurs cycles de PCR pour incorporer les jonctions P5, P7 et les index.
• Dépistage de fragments pour le contrôle de qualité.
• Séquençage.

Préparation de bibliothèque ADN PCR-free Illumina

Dans le processus de Tagmentation de préparation PCR-Free de l'ADN Illumina, les étapes suivantes sont impliquées :

Le nom du produit est passé de Nextera DNA Flex à Illumina DNA Prep, reflétant sa dépendance à la méthode de tagmentation sur perles.

Cette méthode innovante combine l'extraction d'ADN, la fragmentation, la préparation de bibliothèque et la normalisation de bibliothèque en un seul processus rationalisé. Dans un premier temps, les BLT (Transposomes liés à des billes) fragmentent enzymatiquement l'ADN génomique (ADNg) tout en attachant simultanément les amorces de séquençage d'Illumina. Par la suite, l'ADNg fragmenté subit une amplification PCR, incorporant des étiquettes de séquence et des jonctions. Ensuite, les fragments séquencés subissent une purification, et la bibliothèque est préparée pour le séquençage.

Autres méthodes de construction de bibliothèques NGS

La construction de bibliothèques NGS peut être catégorisée en cinq types en fonction des différentes approches pour assembler les fragments cibles.

• Méthode de ligation par clonage TA : Cette méthode largement utilisée est applicable à la plupart des échantillons et représente l'approche principale de construction de bibliothèques commerciales.
• Méthode Swift : Semblable à la méthode de ligation par clonage TA, la méthode Swift implique des opérations légèrement plus complexes. Notamment, la connexion des adaptateurs P5 et P7 se fait en deux étapes.
• Méthode de transposase : Cette méthode permet de compléter la construction de la bibliothèque en seulement 1 heure et 40 minutes, réduisant ainsi considérablement les besoins en main-d'œuvre. Cependant, elle n'est adaptée que pour la construction de bibliothèques cDNA et de génomes entiers. De plus, l'enzyme transposase présente des préférences qui peuvent affecter la qualité du séquençage.
• Construction de bibliothèques d'amplicons PCR : Cette approche, connue sous le nom de construction de bibliothèques de capture, est particulièrement utile pour la recherche de gènes ciblés dans des contextes cliniques.
• Bibliothèque de jonction à extrémité plate : Conçue spécifiquement pour la plateforme Ion Torrent, cette méthode est limitée dans son application en raison de la part de marché relativement faible d'Ion Torrent. Par conséquent, son utilisation est relativement restreinte.

Références :

1. Holm, Johanna B., et al. "Multiplexage et séquençage à ultra-haut débit de régions d'amplicons de plus de 500 pb sur la plateforme Illumina HiSeq 2500." bioRxiv (2018) : 417618.
2. Bourlat, Sarah J., et al. "Préparation de bibliothèques d'amplicons pour le métabarcodage des eucaryotes marins utilisant Illumina MiSeq : la méthode du double PCR." Génomique marine : Méthodes et protocoles (2016) : 197-207.