Génotypage par séquençage : Principes, protocoles et applications

L'ère génomique a ouvert la voie à une pléthore de technologies pour faciliter le génotypage à haut débit. Parmi celles-ci, génotypage par séquençage (GBS) est apparu comme une approche prometteuse et rentable qui a gagné une immense popularité dans le domaine de la sélection végétale et de la génétique. En essence, le GBS consiste à séquencer un sous-ensemble du génome en utilisant une enzyme de restriction pour générer une bibliothèque de fragments à représentation réduite, qui sont ensuite séquencés à l'aide de technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS)Cependant, les principes et protocoles du GBS ne sont pas sans leurs complexités, et une attention appropriée doit être accordée pour garantir des résultats optimaux.

Malgré sa relative simplicité, le GBS présente à la fois des avantages et des inconvénients qui doivent être pris en compte lors de l'utilisation de cette technologie. D'une part, le GBS est très efficace et capable de produire des données de génotypage de haute qualité à une fraction du coût des méthodes de génotypage traditionnelles. De plus, le GBS est hautement évolutif, permettant l'interrogation d'un grand nombre d'échantillons simultanément, ce qui est particulièrement utile dans le contexte de la sélection végétale et des études génétiques. D'autre part, le GBS a des limitations, telles que le potentiel de données manquantes en raison de la distribution non aléatoire des sites d'enzymes de restriction dans le génome. En outre, le GBS nécessite une attention particulière à la chaîne bioinformatique pour l'appel de variants, qui peut être complexe et exigeante en calcul.

GBS représente un outil puissant dans l'arsenal du génotypage, avec de nombreuses applications en amélioration des plantes et en génétique. En fournissant un aperçu complet des principes, des protocoles, des avantages et des inconvénients du GBS, nous espérons doter les lecteurs des connaissances nécessaires pour utiliser efficacement cette technologie dans leurs travaux de recherche.

Principes et Protocoles du GBS

Le principe du GBS consiste à séquencer des régions génomiques flanquées de sites de restriction. Cette méthode implique la digestion de l'ADN génomique avec une enzyme de restriction, la ligature d'adaptateurs aux extrémités des fragments résultants, et l'amplification de la bibliothèque par PCR. La bibliothèque résultante est ensuite séquencée en utilisant des technologies de séquençage à haut débit. Les lectures de séquençage sont ensuite alignées sur un génome de référence ou assemblées de novo pour identifier des variations génétiques telles que des polymorphismes de nucléotides uniques (SNP) et des insertions-délétions (INDEL).

Extraction d'ADNUne ADN de haute qualité doit être extrait de l'organisme d'intérêt. Cet ADN est ensuite fragmenté en morceaux d'une taille spécifique. L'extraction de l'ADN est une étape cruciale dans le protocole GBS, car une ADN de haute qualité est nécessaire pour une préparation de bibliothèque et un séquençage réussis. Il existe plusieurs méthodes d'extraction de l'ADN, y compris le CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium), les colonnes à base de silice et les billes magnétiques. Le choix de la méthode dépend de l'organisme d'intérêt et de la qualité et de la quantité d'ADN requises.

Préparation de la bibliothèqueLes fragments sont ensuite ligaturés à des adaptateurs qui permettent l'amplification et le séquençage. Cette étape implique l'amplification par PCR des fragments pour créer une bibliothèque de fragments d'ADN pouvant être séquencés. Le choix de l'adaptateur et des amorces PCR peut affecter la qualité et la quantité de la bibliothèque résultante. Il existe plusieurs kits de préparation de bibliothèque GBS disponibles dans le commerce, tels que le kit de préparation de bibliothèque d'ADN PCR-Free Illumina TruSeq, qui peut simplifier le processus de préparation de la bibliothèque.

SéquençageLa bibliothèque est ensuite séquencée à l'aide de technologies de séquençage à haut débit. Les lectures résultantes sont ensuite alignées sur un génome de référence, si disponible, ou assemblées de novo en contigs. Les bibliothèques GBS peuvent être séquencées à l'aide de technologies de séquençage à haut débit, telles qu'Illumina ou Ion Torrent. Le choix de la plateforme de séquençage dépend des exigences de l'étude, telles que la longueur des lectures, la profondeur de couverture et le coût. Le séquençage Illumina est largement utilisé pour le GBS en raison de sa grande précision et de son faible coût.

Appel de SNPLes lectures alignées sont ensuite analysées pour identifier les SNP et les génotypes. Cela peut être fait en utilisant une variété d'outils logiciels, tels que TASSEL, GATK et Stacks. Le choix du logiciel dépend des exigences de l'étude, telles que la précision, la rapidité et la facilité d'utilisation.

Analyse de donnéesLes données génotypiques résultantes peuvent ensuite être analysées à l'aide de diverses méthodes statistiques, telles que l'analyse en composantes principales (ACP) et les études d'association à l'échelle du génome (GWAS). L'ACP peut être utilisée pour visualiser la structure des populations et identifier des clusters génétiques, tandis que les GWAS peuvent être utilisés pour identifier des associations entre génotypes et phénotypes. D'autres méthodes d'analyse des données incluent l'analyse d'association marqueur-trait et la sélection génomique.

Étapes schématiques du protocole de génotypage par séquençage (GBS) pour l'amélioration des plantes.

Applications du GBS

Ces dernières années, le génotypage par séquençage est devenu une technique puissante pour le génotypage et la découverte de variations génétiques. Le GBS est une approche rentable et évolutive qui permet aux chercheurs d'analyser un grand nombre d'échantillons et d'obtenir des données de génotypage à haute densité.

Amélioration des plantes

Dans le domaine de la sélection des plantes, la quête d'amélioration des cultures est une recherche sans fin qui nécessite le développement et l'utilisation de technologies de pointe. Une de ces technologies qui a émergé comme un outil essentiel dans cette quête est le génotypage par séquençage. Au cours des dernières années, le GBS a été largement adopté par la communauté de la sélection des plantes en raison de sa capacité à identifier des marqueurs génétiques associés à des caractéristiques agronomiques et à la résistance aux maladies, qui peuvent ensuite être utilisés dans la sélection assistée par marqueurs (SAM) pour accélérer le processus de sélection.

Il convient toutefois de noter que la mise en œuvre réussie du GBS dans l'amélioration des plantes nécessite une prise en compte soigneuse de nombreux facteurs, notamment le choix de l'enzyme de restriction, la profondeur de séquençage et le pipeline d'analyse bioinformatique. De plus, l'exactitude et la fiabilité des marqueurs dérivés du GBS doivent être rigoureusement validées pour garantir leur adéquation à la sélection assistée par marqueurs (MAS). Malgré ces défis, le GBS représente un outil puissant pour accélérer les efforts d'amélioration des cultures au sein de la communauté de l'amélioration des plantes.

Élevage animalier

Le domaine de l'élevage animal est rempli de défis et de complexités qui nécessitent le développement et l'application de technologies innovantes. Parmi celles-ci, le génotypage par séquençage (GBS) a émergé comme un outil puissant et polyvalent pour identifier les marqueurs génétiques associés à des traits de production tels que le rendement laitier, la qualité de la viande et la résistance aux maladies. De plus, le GBS peut être utilisé pour estimer la diversité génétique et la structure des populations, ce qui peut éclairer les stratégies de sélection et optimiser l'efficacité des programmes de reproduction.

Dans une étude, le GBS a été utilisé pour identifier des marqueurs SNP qui étaient significativement associés à la résistance aux poux de mer. De plus, l'étude a également estimé la diversité génétique et la structure de la population de saumons, ce qui peut informer la conception de programmes de reproduction visant à améliorer la résistance aux maladies. En utilisant le GBS de cette manière, les éleveurs d'animaux peuvent améliorer l'efficacité des programmes de reproduction et accélérer les progrès des efforts d'amélioration animale.

Génétique des populations

Le génotypage par séquençage (GBS) a ouvert une nouvelle ère de précision et de sophistication dans le domaine de la génétique des populations. Le GBS a permis aux chercheurs d'analyser des milliers de marqueurs génétiques chez plusieurs individus, permettant ainsi une estimation précise de la diversité génétique, de la structure des populations et du flux génétique. Ces informations peuvent éclairer l'histoire évolutive et les processus démographiques des populations, ainsi que fournir des informations précieuses pour les efforts de conservation et de gestion.

Un exemple frappant du potentiel du GBS dans le domaine de la génétique des populations peut être observé dans l'étude du faucon de Nouvelle-Zélande (Falco novaeseelandiae) en danger. En tirant parti de la puissance du GBS, les chercheurs ont pu estimer la diversité génétique et la structure de la population de faucons, éclairant l'architecture génétique sous-jacente de l'espèce. De plus, l'étude a identifié des régions du génome sous sélection, ce qui peut fournir des informations cruciales sur l'adaptation du faucon à son environnement et aider à orienter les efforts de conservation. Avec sa capacité de génotypage à haut débit, rentable et informative, le GBS est prêt à continuer de révolutionner le domaine de la génétique des populations dans les années à venir.

Biologie évolutive

Dans le domaine multifacette de la biologie évolutive, l'avènement du GBS a permis aux chercheurs de s'attaquer à une multitude de questions épineuses, telles que les origines insaisissables des espèces et les bases génétiques complexes de l'adaptation.

GBS a ouvert de nouvelles perspectives d'investigation en permettant aux scientifiques d'examiner la variation génétique à travers une multitude d'espèces ou de populations avec une précision remarquable. Grâce à ces analyses, les chercheurs peuvent détecter les régions du génome qui ont divergé en raison des forces inéluctables de la sélection naturelle. Ces aperçus à la pointe de la technologie sur les bases génétiques complexes des processus évolutifs ont transformé notre compréhension des mécanismes complexes régissant l'évolution des espèces sur cette planète.

Génotypage par séquençage chez les plantes

Le domaine en plein essor de la génétique et de l'amélioration des plantes a subi une transformation profonde, grâce à l'avènement du GBS. Cette méthodologie de pointe a ouvert une nouvelle ère d'analyse génétique, offrant un moyen efficace et rentable de générer une abondance d'informations génétiques.

Le potentiel révolutionnaire du GBS a déclenché une vague de nouvelles applications, y compris la diversité et la conservation des plantes, l'amélioration des cultures et les études d'association à l'échelle du génome. Le colossal trésor de milliers de marqueurs génétiques offert par le GBS a ouvert la voie au développement rapide de nouvelles variétés de cultures avec des caractéristiques améliorées, renforçant l'utilisation durable des précieuses ressources végétales.

Le mélange synergique de GBS avec d'autres technologies innovantes équipe les chercheurs d'un ensemble puissant d'outils pour percer l'architecture génétique complexe des plantes. Ces avancées ont suscité un sentiment croissant d'optimisme quant à l'impact transformateur que GBS aura sur l'avenir de la génétique et de la sélection des plantes.

Avancées dans l'amélioration des plantes utilisant le GBS

L'avènement de la technologie GBS a bouleversé les paradigmes traditionnels dans le domaine de la sélection végétale, en offrant aux sélectionneurs un accès sans précédent à des milliers de marqueurs grâce au séquençage à haut débit, tout en maintenant un flux de travail rentable et efficace. La précision remarquable et la profusion de marqueurs offerts par la technologie GBS ont permis d'identifier et d'isoler des variantes génétiques, y compris les polymorphismes à un seul nucléotide (SNP), les insertions, les délétions et les variants structurels. Cette technologie de pointe a ouvert de nouvelles perspectives pour les chercheurs afin d'explorer et de déchiffrer la diversité génomique, la structure des populations et l'histoire évolutive des plantes, dévoilant ainsi un trésor de gènes et de marqueurs étroitement associés à des traits agronomiques critiques.

Diversité et conservation des plantes

La nature multifacette et complexe de l'étude de la diversité génétique est essentielle non seulement pour l'avancement scientifique, mais aussi pour des raisons de conservation, en particulier pour la préservation des espèces végétales menacées et en danger. Grâce à l'utilisation de la technologie GBS, il est possible d'identifier des marqueurs génétiques uniques spécifiques à certaines populations de plantes, régions géographiques ou habitats, permettant ainsi la conception et la mise en œuvre de stratégies de conservation adaptées aux besoins spécifiques des espèces végétales rares et menacées.

Amélioration des cultures

La technologie innovante du GBS a révolutionné le domaine de l'amélioration des cultures en facilitant l'identification des gènes et des marqueurs moléculaires étroitement associés à des caractéristiques critiques telles que la résistance aux maladies, le rendement et la qualité. La richesse des informations recueillies grâce à l'analyse du GBS peut être exploitée pour développer de nouvelles variétés de cultures avec des caractéristiques améliorées, adaptées à des conditions environnementales spécifiques, ainsi que pour concevoir de nouveaux modèles de sélection génomique pour la reproduction des plantes. Les applications de la technologie GBS dans l'amélioration des cultures sont vastes et variées, et sa capacité à identifier des marqueurs de résistance à des maladies telles que la fusariose de l'épi du blé, le mildiou tardif de la pomme de terre et le nématode à kyste du soja a été tout simplement phénoménale.

Études d'Association à l'Échelle du Génome (GWAS)

Les GWAS ont émergé comme un outil puissant pour découvrir la base génétique des traits complexes chez les plantes, en identifiant des loci qui contrôlent la variation de traits spécifiques et en acquérant une compréhension globale des facteurs génétiques à l'origine de la variation phénotypique.

Malgré son grand potentiel, l'AGM peut être difficile dans les plantes à génomes complexes, où les méthodes de génotypage traditionnelles peuvent s'avérer inefficaces. Dans ce contexte, l'AGM a été révolutionnée par l'avènement du GBS, qui permet l'identification de la variation génétique chez les plantes avec polyploïdie ou des niveaux élevés d'hétérozygotie en exploitant la puissance du séquençage à haut débit.

Avantages et inconvénients du génotypage par séquençage

Conclusion

Le monde du génotypage par séquençage a subi un bouleversement sismique, révolutionnant une myriade de disciplines telles que la sélection des plantes et des animaux, la génétique des populations et la biologie évolutive. La prolifération du GBS a été essentielle pour permettre aux chercheurs de trier un vaste éventail d'échantillons et d'acquérir des données de génotypage à haute densité. Grâce à ce processus, des marqueurs génétiques liés à des traits d'intérêt peuvent être identifiés, fournissant des informations cruciales sur l'architecture génétique complexe sous-jacente à divers phénomènes biologiques. De plus, le GBS a facilité l'estimation de la diversité génétique et de la structure des populations, permettant aux chercheurs de démêler les dynamiques évolutives qui façonnent la vie sur terre.

Chez CD Genomics, nous comprenons l'immense potentiel du GBS pour ouvrir une nouvelle ère de découvertes dans ces domaines. Nous restons fermement engagés à fournir le services GBS de la plus haute qualité aux chercheurs du monde entier, leur permettant de réaliser des avancées qui transforment notre compréhension du monde naturel.

Références :

1. Martin Mascher, Shuangye Wu, Paul St. Amand, Nils Stein, Jesse Poland. Application du génotypage par séquençage sur des plateformes de séquençage à semi-conducteurs : une comparaison de l'ordre des marqueurs génétiques et basés sur des références chez l'orge. ACCÈS OUVERT (2013)
2. Wang, N., Yuan, Y., Wang, H. et al. Applications du génotypage par séquençage (GBS) dans la génétique et l'amélioration du maïs. Sci Rep 10, 16308 (2020)
3. Deschamps S, Llaca V, May GD. Génotypage par séquençage chez les plantes. Biologie (Bâle). 25 sept. 2012;1(3):460-83.
4. Jiangfeng He et al., Génotypage par séquençage (GBS), un outil ultime de sélection assistée par marqueurs (MAS) pour accélérer le breeding des plantes. FSec. Génétique et Génomique Végétales, Front. Plant Sci., 30 septembre 2014.