Exploration des sites CpG par technologie de séquençage

Qu'est-ce qu'une île CpG ?

Les îlots CpG sont des régions spécialisées au sein du génome, souvent enrichies en dinucléotides "CG", que l'on trouve notamment dans les régions promotrices de nombreux gènes, en particulier ceux associés aux fonctions de maintenance cellulaire. Ces sites CpG jouent un rôle crucial dans le recrutement des facteurs de transcription, influençant l'expression des gènes. Le statut de méthylation accru des îlots CpG module en outre le recrutement des facteurs de transcription, impactant ainsi la régulation des gènes. Dans le contexte de la méthylation de l'ADN des mammifères, la méthylation de type CG prévaut, et les sites CpG, riches en dinucléotides CpG, sont généralement situés à proximité des régions régulatrices transcriptionnelles. Fait remarquable, ces îlots CpG sont liés à environ 56 % des gènes codants dans le génome humain, soulignant l'importance primordiale d'étudier leur statut de méthylation dans le domaine de recherche sur la méthylation.

La densité de CpG, étroitement liée à Méthylation de l'ADN les dynamiques dans divers tissus, catégorise le génome en cinq régions : l'île CpG (CGI), la zone située à 2 kb en aval de l'île CpG (plage CpG), et la zone située à 2 kb à la fois en amont et en aval de la plage de l'île CpG (étagère CpG). Les niveaux de méthylation de chaque région sont soigneusement évalués individuellement.

Applications de la recherche sur les CpG

• Recherche épigénétiqueLa méthylation de l'ADN joue un rôle crucial dans la préservation de la fonction cellulaire normale, le maintien de la structure des chromosomes et la facilitation de l'inactivation du chromosome X. L'exploration des îlots CpG contribue à l'avancement de la recherche épigénétique humaine.
• Détection précoce du cancerDes niveaux de méthylation élevés dans les promoteurs de gènes sont fréquemment observés dans la transcription de gènes associés aux tumeurs malignes. Ce phénomène est considéré comme un signe distinctif de la transformation maligne cellulaire, permettant la détection précoce du cancer par séquençage de la méthylation des gènes.
• Recherche sur le développement embryonnaire : Méthylation de l'ADN joue un rôle clé dans l'empreinte génétique et le développement embryonnaire. Les études sur les îlots CpG offrent des informations précieuses pour comprendre les processus complexes impliqués dans le développement embryonnaire.
• Recherche sur les iPSC et les cellules souches : Les îlots CpG sont essentiels dans l'analyse des motifs de méthylation, fournissant des informations sur les processus de différenciation des cellules souches et des cellules souches pluripotentes induites (iPSC).

Séquençage au bisulfite dans la recherche sur les CpG

BS-Seq (Séquençage au bisulfite) se distingue comme la méthode prééminente pour la détection complète de la méthylation à l'échelle du génome. Cette technique implique la conversion des cytosines (C) non méthylées en uracile (U) par traitement au bisulfite. En intégrant le séquençage de deuxième génération et l'analyse subséquente, BS-Seq permet une détection à haut débit des sites de méthylation.

Dans le processus de traitement au bisulfite, les cytosines non méthylées subissent une conversion en uracile, tandis que les cytosines méthylées restent inchangées. Les amorces PCR sont soigneusement conçues en fonction de la séquence du site cible ou de la région d'intérêt. Les produits amplifiés sont soumis à diverses méthodes de détection, y compris l'électrophorèse PCR, le séquençage, la quantification par fluorescence et le séquençage de nouvelle génération (NGS). Les résultats obtenus sont ensuite analysés pour identifier les sites méthylés et déterminer la fréquence de méthylation.

Les étapes procédurales de la méthode BSP sont décrites comme suit :

• Conception de primers BSP : Concevez des primers BSP adaptés à la région génique cible, produisant généralement un produit d'amplification d'environ 300 paires de bases.
• Traitement au bisulfite de l'ADN génomique : Traitez l'ADN génomique avec du bisulfite pour induire la conversion des cytosines non méthylées en uracile.
• Amplification par PCR : Utilisez la PCR pour amplifier la région d'intérêt dans l'échantillon.
• Clonage dans le vecteur : Purifiez les produits de PCR et liguez-les dans des vecteurs couramment utilisés.
• Extraction et séquençage de plasmides : Extraire et séquencer des plasmides à partir d'une sélection de clones positifs, en sélectionnant généralement 10 pour l'inoculation et la culture. Cette étape permet un examen détaillé des motifs de méthylation au niveau moléculaire.

Séquençage par nanopore

La plateforme ONT (Oxford Nanopore Technologies) distingue l'état de méthylation des bases, telles que 5mC ou 6mA, en analysant les modifications du signal électrique lorsque la base traverse le micro-puits nanopore.

Séquençage par nanopore exhibe la capacité remarquable d'identifier directement les cytosines méthylées, y compris celles situées aux sites CpG, éliminant ainsi la nécessité d'une conversion au bisulfite. Cette technologie est particulièrement douée pour discerner les motifs de méthylation dans des clusters à haute densité connus sous le nom d'îlots CpG (CGI).