Protocole de séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS)

Digestion de l'ADN génomique par MspI

Ajoutez 100 ng (dans 25 μL) d'ADN génomique dans un tube de 0,2 mL et gardez la bande de huit tubes sur de la glace.
2. Préparez un mélange maître de 10 Buffer Tango (3 μL) et MspI (10 U/μL) (2 μL), et gardez le mélange maître sur glace. Ajoutez 5 μL du mélange maître au tube de 0,2 mL contenant de l'ADN génomique. Mélangez par pipetage et fermez la bande de huit tubes avec une bande de huit bouchons.
3. Placez la bande de huit tubes (0,2 mL) sur un thermocycleur et exécutez le programme thermique suivant pour la digestion par MspI : 37°C pendant 120 min ; maintien à 4°C (couvercle chauffé à 50°C).

Réparation de fin et dA-Tailing

1. Centrifuge la bande de huit tubes (0,2 mL) contenant l'ADN digéré par MspI. Retirez délicatement la bande de huit bouchons sans éclabousser la solution d'ADN dans les tubes. Gardez la bande de huit tubes sur de la glace. Ajoutez 1 μL de mélange de dNTP pour RRBS et 1 μL de fragment de Klenow (exo-) à chaque tube et mélangez par pipetage (32 μL au total). Fermez les tubes avec une nouvelle bande de huit bouchons.
2. Placez la bande de huit tubes (0,2 mL) sur un thermocycleur et exécutez le programme thermique suivant : 30°C pendant 20 min et 37°C pendant 20 min ; maintenez à 4°C (couvercle chauffé à 50°C).
3. Ajoutez 64 μL (2 volumes) de billes AMPure XP à la solution d'ADN. Effectuez la purification avec les billes AMPure XP et éluez l'ADN avec 18 μL de Tris–Cl à 10 mM (pH 8,5). Transférez 17,7 μL de la solution d'ADN élue dans un nouveau tube à huit (0,2 mL).

Ligation d'adaptateurs

1. Gardez l'ADN élut dans la bande de huit tubes (0,2 mL) sur glace. Ajoutez 2,3 μL de tampon de réaction NEBNext Ultra II End Prep à l'ADN élut (20,0 μL au total).
2. Préparez un mélange maître pour le NEBNext Ultra II Ligation Master Mix (10,0 μL) et le NEBNext Ligation Enhancer (0,33 μL), qui sont tous deux inclus dans le réactif 5 dans le sous-titre 2.1. Mélangez le mélange maître en pipetant de haut en bas dix fois. Ajoutez 10,33 μL du mélange maître à l'ADN éluté et mélangez en pipetant de haut en bas trois fois. Ajoutez 0,83 μL de NEBNext Methylated Adaptor (2 μM) à chaque tube et mélangez en pipetant de haut en bas dix fois (31,16 μL au total). Fermez la bande de huit tubes avec une nouvelle bande de huit bouchons.
3. Placez la bande de huit tubes sur un cycler thermique et exécutez le programme thermique suivant : 20 °C pendant 60 min ; maintenez à 4 °C (couvercle chauffé à 50 °C). Après avoir retiré la bande à huit bouchons, gardez la bande de huit tubes sur de la glace. Ajoutez 1 μL d'enzyme de réactif d'excision spécifique à l'uracile, mélangez par pipetage et fermez la bande de huit tubes avec une nouvelle bande à huit bouchons. Placez les tubes sur un cycler thermique et exécutez le programme thermique suivant (Programme D) : 37 °C pendant 15 min ; maintenez à 4 °C (couvercle chauffé à 50 °C). Conservez les tubes contenant l'ADN lié à l'adaptateur à -20 °C jusqu'au lendemain.
4. Ajoutez 48 μL (1,5 volumes) de billes AMPure XP à la solution d'ADN. Effectuez la purification avec les billes AMPure XP et éluez l'ADN avec 20 μL de Tris–Cl à 10 mM (pH 8,5).

Conversion au bisulfite de l'ADN ligaturé à un adaptateur

1. Effectuer la conversion au bisulfite de l'ADN lié à l'adaptateur en utilisant le kit EZ Methylation Gold. Le programme thermique requis pour la conversion au bisulfite est de 98 °C pendant 10 minutes et de 64 °C pendant 150 minutes, puis maintenir à 4 °C (couvercle chauffant à 105 °C). Ajouter 130 μL de réactif de conversion CT à l'ADN purifié lié à l'adaptateur (20 μL), et diviser la solution en deux tubes de 0,2 mL (75 μL chacun). Placer les bandes de huit tubes sur un cycler thermique et exécuter. Après l'achèvement, combiner les deux aliquotes de 75 μL dans un tube. Effectuer les procédures suivantes selon le protocole du fabricant du kit EZ Methylation Gold. Éluer l'ADN converti au bisulfite avec 11 μL de tampon M-Elusion.

Amplification par PCR

1. Transférez 10,0 μL d'ADN traité au bisulfite dans un tube de 0,2 mL. Ajoutez 1,25 μL de l'amorce i7 (10 μM) et 1,25 μL de l'amorce i5 (10 μM) à l'ADN traité au bisulfite, puis mélangez brièvement. Ajoutez 12,5 μL de 2 KAPA HiFi Hot Start Uracil+ Ready Mix et mélangez par pipetage (25,0 μL au total).
2. Réalisez une amplification PCR en utilisant les conditions de cyclage thermique suivantes (Programme F) : 98°C pendant 45 s pour la dénaturation initiale, neuf cycles de 98°C pendant 15 s, 60°C pendant 30 s et 72°C pendant 30 s pour l'amplification, puis 72°C pendant 1 min pour l'extension finale ; maintenez à 4°C (couvercle chauffant à 105°C). Les échantillons d'ADN amplifiés peuvent être conservés une nuit à 4°C dans un thermocycleur ou plus longtemps à -20°C.

Contrôle de qualité de la bibliothèque

1. Lorsque le kit ADN à haute sensibilité est utilisé, 1 μL de chaque bibliothèque RRBS purifiée est soumis à une analyse électrophorétique basée sur des microcapillaires.
2. Mesurez la molarité de chaque bibliothèque (pour la plage de 200 pb à 1000 pb). Vérifiez la distribution de la taille des fragments de chaque bibliothèque.

Séquençage

1. Séquençage de test sur la plateforme MiSeq et réajustement de la concentration en ADN de la bibliothèque : Préparez plus de 2 μL de solution à 2 nM pour chaque bibliothèque. Regroupez 2 μL de chaque bibliothèque à 2 nM (un total de 16 μL dans le cas de huit bibliothèques). Pour un séquençage de test utilisant un kit de réactifs MiSeq Nano Kit v2 (300 cycles), mélangez 92 μL de Tris–Cl à 10 mM (pH 8,5), 2 μL du pool de bibliothèques à 2 nM et 1 μL de la bibliothèque de contrôle PhiX v3 à 1 nM (95 μL au total) dans un tube de 1,5 mL. Ajoutez 5 μL de NaOH à 2 N au mélange de 95 μL, mélangez par vortexage et laissez le tube à température ambiante pendant 5 minutes pour dénaturer le mélange d'ADN de la bibliothèque. Ajoutez 500 μL de tampon A glacé, mélangez et gardez la solution sur glace pendant 5 minutes. La concentration finale de la solution de bibliothèque dénaturée (600 μL au total), incluant 20 % de la bibliothèque de contrôle PhiX v3 ajoutée pour équilibrer la couleur de la faible diversité de nucléotides, est de 8,3 pM. Effectuez le séquençage de test sur une plateforme MiSeq en utilisant le flux de travail Generate FASTQ.
2. Après l'achèvement de la course MiSeq, vérifiez les ratios d'index des bibliothèques RRBS et recalculer la concentration des bibliothèques en fonction des ratios d'index.
3. Réaliser un séquençage à grande échelle sur la plateforme HiSeq X. Préparer un pool de bibliothèques RRBS suffisant pour le séquençage.