Aperçu de l'analyse des données RRBS : pipeline, outils d'alignement, bases de données et défis

Le développement rapide des technologies de séquençage à haut débit offre désormais des opportunités d'interroger la méthylation de l'ADN à une résolution de base unique avec une couverture élevée à grande échelle. Le séquençage au bisulfite est la norme d'or pour mesurer la méthylation sur les génomes d'intérêt (Wreczycka et al., 2017). Le séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS) a été largement utilisé pour étudier la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome en raison de son coût de séquençage considérablement réduit et de sa couverture et sensibilité de séquençage élevées (Gu et al., 2010 ; Meissner et al., 2005).

Introduction à RRBS

RRBS est une méthode standardisée largement utilisée pour l'analyse de la méthylation de l'ADN, qui délimite précisément les motifs de méthylation dans les génomes en s'appuyant sur la technologie de séquençage combinée à une analyse bioinformatique. Cette méthode offre l'avantage d'une analyse à haute résolution au niveau d'une seule base, facilitant ainsi une évaluation précise du statut de méthylation de chaque base de cytosine, avec un coût notablement efficace. L'application de RRBS couvre un large éventail en biologie et en recherche médicale. Il a été largement approprié pour étudier divers sujets tels que les facteurs de risque de maladies, les traits génétiques, la découverte de biomarqueurs, la tumorigenèse, les troubles mentaux, les maladies métaboliques, les troubles auto-immuns, ainsi que les améliorations dans les programmes de reproduction des plantes et des animaux et la recherche reproductive.

Application de RRBS

RRBS sert de méthode puissante pour explorer les motifs de méthylation à l'échelle du génome et aide les chercheurs à cartographier les paysages de méthylation à travers diverses régions génomiques englobant les promoteurs, les zones intergéniques, les introns et les sites de terminaison de transcription. De telles investigations révèlent le rôle fonctionnel de la méthylation de l'ADN dans l'orchestration de la régulation génique et le contexte plus large de l'hérédité épigénétique. En juxtaposant les niveaux de méthylation à travers divers échantillons, on peut identifier des sites de méthylation différentiellement modifiés - des positions génomiques montrant des variations notables dans leurs statuts de méthylation sous différents états physiologiques, conditions pathologiques ou circonstances environnementales. Ces découvertes jouent un rôle significatif dans le déchiffrement de la pathogénie des maladies, l'identification de biomarqueurs potentiels et la compréhension de l'impact des facteurs environnementaux sur la méthylation du génome.

RRBS est souvent utilisé dans la recherche sur le cancer. En contrastant les différences de méthylation entre des échantillons cancéreux et leurs homologues normaux, le RRBS peut faciliter la découverte de marqueurs de méthylation pertinents pour le début et la progression du cancer. Cette approche est cruciale pour la détection précoce du cancer, l'identification de cibles thérapeutiques et l'élucidation des mécanismes de développement des tumeurs. De plus, les données RRBS peuvent également contribuer de manière significative à la recherche épigénétique, y compris l'analyse des motifs de méthylation spécifiques aux tissus, l'examen des variations génétiques de méthylation interindividuelles et les enquêtes sur l'impact des facteurs environnementaux sur la méthylation génomique.

Le RRBS a été largement utilisé dans l'agriculture pour étudier le développement des cultures, leur adaptabilité et leurs caractéristiques agronomiques. En comparant les motifs de méthylation à travers différentes variétés de cultures, des marqueurs de méthylation particuliers associés à des caractéristiques agronomiques essentielles telles que le rendement, la qualité et la résilience peuvent être révélés. Ces informations aident à la sélection de variétés supérieures et à l'amélioration génétique ciblée, offrant un moyen d'augmenter à la fois le rendement et la tolérance environnementale. RRBS renforce la recherche sur les changements dynamiques de la méthylation de l'ADN tout au long de la croissance et du développement des cultures. Une analyse des motifs de méthylation à différents stades de croissance ou au sein d'organes distincts peut déchiffrer le rôle de la méthylation génomique dans l'orchestration des processus de croissance, révélant des sites de méthylation et des réseaux liés à la régulation de la croissance.

De plus, RRBS les données peuvent être associées à Séquençage de l'ARN des données pour effectuer des analyses corrélationnelles entre la méthylation et l'expression génique. En reliant les sites de méthylation aux niveaux d'expression génique, le rôle régulateur de la méthylation dans l'expression génique peut être révélé, et des réseaux régulateurs pertinents pour des processus biologiques spécifiques ou des maladies peuvent être identifiés.

Pipeline d'analyse des données RRBS

L'analyse des motifs de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome est essentielle pour comprendre les mécanismes sous-jacents de la méthylation de l'ADN. Le pipeline computationnel pour l'analyse de RRBS les données sont présentées dans la Figure 1.

Figure 1. Pipeline pour l'analyse des données RRBS. CpG : séquences CG, C est la cytosine et G est la guanine. CHG et CHH : H est A (adénine), C ou T (thymine).

L'analyse de RRBS les données englobent généralement les étapes suivantes :

Contrôle de la qualité : Le contrôle de la qualité est la première étape de l'analyse des données, garantissant une haute qualité et fiabilité des données. Cette étape utilise généralement des outils comme FastQC pour évaluer la qualité des données de séquençage brutes. Ces outils examinent des métriques telles que la distribution de la qualité des bases, le contenu en GC, la distribution de la longueur des séquences et la sur-représentation pour identifier la contamination, les séquences de faible qualité ou d'autres problèmes, permettant ainsi de prendre des mesures appropriées de filtrage et de découpage.

Alignement au génome de référence : Une fois passé par le contrôle qualité, les données de séquençage filtrées sont alignées sur un génome de référence. RRBS analyse de données, en raison de la méthode ciblant des fragments d'ADN spécifiques, le processus d'alignement doit prendre en compte la spécificité des sites de clivage enzymatique. Les outils d'alignement courants incluent Bismark, BSseeker2, etc. Les résultats d'alignement sont généralement enregistrés au format SAM ou BAM pour l'identification et l'analyse ultérieures des sites méthylés.

Identification des sites méthylés : Suite à l'alignement des données, il est impératif d'identifier les sites méthylés. Cette étape cruciale se déroule généralement en deux phases : l'identification basée sur l'alignement et l'identification basée sur la proportion. La première repose sur la distinction des sites méthylés en contrastant les séquences méthylées avec le génome de référence. En revanche, la seconde approche consiste à estimer les niveaux de méthylation à chaque site par le biais d'une analyse statistique.

Estimation des niveaux de méthylation : Une fois que les sites méthylés ont été identifiés, la tâche suivante consiste à quantifier leurs niveaux de méthylation. En général, cela implique d'estimer les niveaux de méthylation en calculant le rapport entre les fragments méthylés et les fragments non méthylés dans les données de séquençage. Ces rapports sont couramment appelés valeurs bêta (valeurs β) ou ratios de méthylation. Grâce à cette estimation, des informations sur le degré de méthylation à divers loci génomiques peuvent être obtenues, améliorant ainsi notre compréhension des modifications épigénétiques.

Figure 2. Graphique MD montrant le log-fold-change du niveau de méthylation et l'abondance moyenne de chaque site CpG. (Chen et al., 2017)

Analyse de la méthylation différentielle : Suite à l'estimation du niveau de méthylation, l'analyse de méthylation différentielle compare les niveaux de méthylation entre différents échantillons afin d'identifier les sites méthylés de manière différentielle. Cette analyse utilise généralement des méthodes statistiques (par exemple, limma, edgeR, DMRcate) pour tester les différences significatives dans les niveaux de méthylation et déterminer les sites méthylés de manière différentielle en fonction de seuils prédéfinis.

Annotation fonctionnelle : L'annotation fonctionnelle des sites de méthylation différentielle aide à comprendre leur distribution génomique et leurs fonctions biologiques. Cette étape implique généralement l'utilisation d'informations d'annotation génomique telles que les structures géniques, les régions promotrices, les enhancers, etc. Associer les sites de méthylation différentielle à des fonctions biologiques explore davantage la signification biologique de la méthylation.

Analyse des voies : Suite à l'analyse différentielle de la méthylation, une analyse des voies métaboliques est souvent réalisée sur les gènes différentialement méthylés afin de comprendre leurs voies fonctionnelles et leurs réseaux d'interaction dans les processus biologiques. L'analyse des voies utilise généralement des bases de données et des outils de bioinformatique (par exemple, DAVID, Enrichr, GSEA) pour identifier les voies biologiques et les modules fonctionnels associés aux gènes différentialement méthylés.

Outils d'analyse de données RRBS

En raison de la complexité des alignements de séquençage au bisulfite (les séquences alignées ne correspondent pas exactement au génome de référence, et la complexité des bibliothèques est réduite), les logiciels d'alignement de séquences standard ne peuvent pas être utilisés. En raison des propriétés uniques de RRBSDes outils spéciaux sont nécessaires pour l'alignement et l'analyse. Cinq algorithmes de cartographie couramment utilisés pour l'analyse de référence dans les données RRBS incluent Bismark, BS-Seeker2, BSMAP, GSNAP et bwa-meth, qui sont répertoriés dans le Tableau 1 (Sun et al., 2018).

Tableau 1. Brève description des différents outils d'alignement pour l'analyse des données RRBS.

Bismark est un outil largement utilisé dans l'analyse des données RRBS en raison de son efficacité, de sa précision et de sa haute fiabilité. Il gère habilement les particularités inhérentes à RRBS des données, telles que la présence de sites de coupure d'enzymes de restriction et l'hétérogénéité de la méthylation de l'ADN. Cependant, son inconvénient est une vitesse de traitement plus lente pour les données à grande échelle, en particulier avec des génomes plus grands. Bismark peut être utilisé pour aligner Séquençage RRBS données à un génome de référence, ainsi que d'identifier et d'analyser les sites de méthylation.

En revanche, BSseeker2 constitue un autre outil populaire pour l'analyse des données RRBS, réputé pour sa forte performance lors du traitement de données à grande échelle et sa vitesse d'alignement plus rapide. L'installation et la configuration de BSseeker2 peuvent nécessiter un peu plus de travail par rapport à d'autres outils. Néanmoins, il s'avère compétent pour faire correspondre les données de séquençage RRBS, reconnaître les sites de méthylation et effectuer des analyses de méthylation différentielle.

BSMAP, bien que simple et pratique à utiliser avec un processus d'installation et de configuration straightforward, excelle principalement avec des échelles réduites. RRBS données en raison de sa grande précision. Cependant, il se peut qu'il ne soit pas aussi efficace que d'autres algorithmes en réponse à des motifs de méthylation complexes.

GSNAP est polyvalent, servant non seulement à l'alignement des données de séquençage ADN mais aussi des données de séquençage ARN, entre autres applications. Il démontre de solides performances dans le traitement de jeux de données génomiques complexes, affichant une grande précision d'alignement. Cependant, son inconvénient réside dans un traitement potentiellement plus lent des données RRBS à grande échelle et dans la configuration et l'utilisation relativement complexes.

bwa-meth, conçu spécifiquement pour les données de méthylation, est particulièrement bien adapté au traitement des données de séquençage RRBS et de méthylomes similaires. Il fonctionne admirablement lorsqu'il s'agit de traiter des échelles réduites. RRBS données, se vantant de vitesses d'alignement élevées. Néanmoins, la gestion de certains cas spécialisés peut présenter une certaine complexité.

MethylDackel, un outil léger, se spécialise dans l'alignement et l'identification des sites méthylés dans les données de séquençage RRBS et d'autres méthylomes. Il se distingue par son efficacité et sa simplicité, ce qui le rend adapté au traitement rapide de jeux de données RRBS de petite taille. Néanmoins, sa fonctionnalité peut être relativement basique, manquant des capacités d'analyse étendues d'autres outils. MethylDackel trouve son utilité dans le traitement rapide de jeux de données de taille modeste. RRBS données et réalisation d'une identification préliminaire des sites de méthylation.

Trim Galore fonctionne généralement comme un outil de prétraitement, dédié au contrôle de qualité et au filtrage. RRBS données. Il détecte automatiquement et élimine les séquences de faible qualité dans les données de séquençage, améliorant ainsi la qualité des données. Cependant, Trim Galore lui-même ne réalise pas d'alignement ni d'identification des sites de méthylation et nécessite une intégration avec d'autres outils pour une analyse complète.

Bases de données sur la méthylation de l'ADN

Consacrés au stockage et à la gestion des données de méthylation de l'ADN, les bases de données de méthylation de l'ADN sont des ressources inestimables qui compilent un corpus substantiel de données de méthylation, englobant différentes espèces, types cellulaires, types de tissus et états physiologiques. Ces bases de données offrent généralement divers types de données comprenant des données de méthylation du génome entier, des informations sur les loci de méthylation annotés, des paysages de méthylation, ainsi que des fonctionnalités et des régulations des modifications de méthylation. Étant donné le grand volume de données de méthylation que ces bases de données contiennent, les chercheurs peuvent explorer la distribution, la régulation et les fonctions de la méthylation de l'ADN à travers le génome en recherchant et en analysant les données disponibles. De plus, elles peuvent aider les chercheurs à comprendre les rôles et les mécanismes de la méthylation de l'ADN dans les processus biologiques, y compris l'expression génique, la différenciation cellulaire, le développement et la progression des maladies. La recherche basée sur les données de méthylation de l'ADN nécessite le développement et le déploiement de divers outils et algorithmes bioinformatiques, et ces bases de données fournissent une base de données essentielle et une plateforme de vérification pour le développement d'outils.

Les bases de données courantes sur la méthylation de l'ADN comprennent :

Navigateur de génome UCSC : Agissant comme un navigateur génomique en ligne, le UCSC Genome Browser fournit des données de méthylation complètes couvrant diverses espèces. Les utilisateurs peuvent accéder à divers ensembles de données de méthylation, couvrant différents tissus, types de cellules et états de maladie.

ENCODER : Le projet ENCODE (Encyclopédie des éléments de l'ADN) est une initiative de recherche complète visant à identifier et annoter les éléments fonctionnels au sein du génome humain. Cette initiative regroupe d'énormes quantités de données génomiques fonctionnelles, y compris des données de méthylation de l'ADN, offrant aux chercheurs des ressources complètes d'annotation fonctionnelle génomique.

Feuille de route du projet d'épigénomique : Le projet Roadmap Epigenomics est une collaboration internationale à grande échelle visant à construire des cartes épigénomiques pour les humains et les organismes modèles. Il regroupe diverses données épigénomiques, y compris des données de méthylation de l'ADN, fournissant aux chercheurs de nombreuses ressources épigénomiques.

TCGA : L'Atlas du Génome du Cancer (TCGA) est un projet international à grande échelle qui collecte des données génomiques provenant de divers échantillons de cancer. Il englobe des quantités significatives de données de méthylation provenant d'échantillons de cancer, constituant une ressource essentielle pour la recherche sur le cancer.

DDBJ/EMBL/GenBank : DDBJ (Banque de données ADN du Japon), EMBL (Laboratoire européen de biologie moléculaire) et GenBank représentent trois grandes bases de données de séquences génomiques qui collectent des séquences génomiques à l'échelle mondiale et des informations biologiques connexes, y compris des données de méthylation de l'ADN.

GÉO : GEO (Gene Expression Omnibus) sert de dépôt public pour les données génomiques, rassemblant d'importants ensembles de données sur l'expression génique et l'épigénomique, y compris les données de méthylation de l'ADN.

Une grande quantité de données a été générée par les technologies de détection de la méthylation de l'ADN basées sur le séquençage de nouvelle génération (NGS) au cours des dernières années. Plusieurs bases de données sur la méthylation ont été développées pour stocker ces données et sont disponibles pour les chercheurs (Tableau 2) (Su et al., 2012). Avec le développement d'une étude sur la méthylation de l'ADN, d'autres bases de données seront établies et davantage d'informations sur la méthylation seront connues.

Tableau 2. Bases de données sur la méthylation de l'ADN.

Défis de l'appel de méthylation dans l'analyse des données RRBS

Il existe deux facteurs clés affectant l'exactitude des appels de méthylation lors de la détermination de l'état de méthylation des lectures de séquençage au bisulfite. Tout d'abord, les lectures de séquençage doivent être correctes et provenir entièrement de séquences converties au bisulfite. Deuxièmement, les lectures doivent être correctement alignées au génome de référence. L'échec de ces deux facteurs entraînera la génération d'appels de méthylation incorrects. Et dans des cas extrêmes, le bruit provenant de ces erreurs peut nuire aux conclusions de l'expérience (Krueger et al., 2012). Le processus de digestion par des enzymes de restriction (utilisant couramment l'endonucléase de restriction MspI), la conversion au bisulfite et le séquençage impliqués dans RRBS affecterait ces deux facteurs.

• Digestion par MspI

La digestion par MspI donnerait lieu à une large gamme de fragments d'ADN de différentes tailles (Figure 3), et généralement, des fragments entre 40 et 220 pb seront sélectionnés par taille pour la bibliothèque RRBS. Un certain nombre de fragments digérés par MspI, même plus courts que 40 pb, seront générés au cours du processus. Si le processus de sélection par taille n'est pas aussi bon qu'en théorie, un nombre considérable de fragments inférieurs à 40 pb peut se retrouver dans le RRBS bibliothèque.

Figure 3. Les fréquences relatives des tailles des produits de digestion par MspI dans le génome de référence humain. (Suzuki et al., 2010)

Les fragments plus courts sont plus susceptibles d'être séquencés que les fragments plus longs (≥300 pb). Cependant, les lectures courtes dans les données de séquençage au bisulfite pourraient entraîner une faible efficacité de mappage lors de l'analyse des données (Figure 4).

Figure 4. Performance de la cartographie tenant compte de la méthylation (biaisée) et de la cartographie non biaisée pour les données de séquençage de méthylation. (Krueger et al., 2012)

• Conversion au bisulfite

Le traitement au bisulfite de l'ADN entraîne la désamination de la cytosine non méthylée en uracile, et ces résidus convertis seront lus comme de la thymine, ce qui est déterminé par l'amplification par PCR et l'analyse de séquençage ultérieure (Figure 5).

Figure 5. Le principe du séquençage au bisulfite.

Le séquençage par bisulfite repose sur la conversion de chaque résidu de cytosine non méthylé en uracile. Une conversion incomplète entraînera des résultats faussement positifs en raison de l'interprétation incorrecte des cytosines non méthylées non converties comme des cytosines méthylées (Figure 6).

Figure 6. Conversion incomplète du bisulfite.

• Séquençage

En raison de la taille courte des fragments sélectionnés dans la bibliothèque RRBS, plusieurs facteurs du processus de séquençage pourraient affecter le RRBS analyse des données (Krueger et al., 2012) :

Qualités des appels de bases : La qualité des appels de bases tend à diminuer à mesure que la longueur des lectures augmente. Les mauvaises qualités de bases pourraient entraîner des appels de méthylation incorrects et/ou des erreurs de cartographie.

Erreurs d'appel de base : Les erreurs de séquençage dans les lectures peuvent entraîner une faible efficacité de mappage (lectures non alignées du tout), des appels de méthylation incorrects ou des désalignements, ce qui conduira également très probablement à des appels de méthylation incorrects.

Contamination par l'adaptateur : Dans de nombreuses bibliothèques, une proportion des lectures passera par l'insertion et commencera à séquencer l'adaptateur à l'extrémité 3'. Une telle "contamination par l'adaptateur" peut entraîner de faibles efficacités de cartographie si la lecture échoue à s'aligner, ou, si elle est cartographiée, peut conduire à de faux alignements qui peuvent entraîner des appels de méthylation incorrects.

Réparation de fin : Les positions remplies lors de la réparation de fin indiqueront l'état de méthylation de la cytosine utilisée pour la réaction de remplissage, mais pas de la véritable cytosine génomique.

Séquençage en paire : Paire-end Séquençage RRBS (surtout avec une longueur de lecture longue) produisent des informations de méthylation redondantes si les paires de lectures se chevauchent.

Chez CD Genomics, nous sommes dédiés à fournir des solutions fiables. séquençage épigénomique services, y compris séquençage bisulfite ciblé, séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS), séquençage bisulfite de tout le génome, Séquençage MeDIP, et ChIP-seq.

Références :

1. Gu, H., et al., Cartographie de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome des échantillons cliniques à la résolution d'un seul nucléotide. Méthodes de la nature, 2010, (7):133-136.
2. Krueger, F., et al., Analyse du méthylome de l'ADN à l'aide de données de séquençage bisulfite courtes. Méthodes de la nature 2012,9,145-151.
3. Meissner, A., et al., Séquençage bisulfite à représentation réduite pour une analyse comparative de la méthylation de l'ADN à haute résolution. Recherche sur les acides nucléiques, 2005, (33):5868-5877.
4. Su J., et al., Avancées dans les outils de bioinformatique pour les données de séquençage à haut débit de la méthylation de l'ADN. Génétique héréditaire, 2012(1):107.
5. Sun, X., et al. Une évaluation complète des logiciels d'alignement pour les données de séquençage bisulfite à représentation réduite. Bioinformatique, 2018(34):2715-2723.
6. Suzuki, M., et al. Conception optimisée et analyse des données des tests de méthylation de la cytosine basés sur des étiquettes. Biologie du génome, 2010(11) : R36.
7. Wreczycka, K., et al., Stratégies pour analyser les données de séquençage au bisulfite. Journal de biotechnologie, 2017(261):105-115.
8. Chen Y, Pal B, Visvader J E, et al. Analyse de méthylation différentielle des expériences de séquençage bisulfite à représentation réduite en utilisant edgeR. F1000Research, 2017, 6.