Séquençage du génome entier microbien par le protocole NGS

Collection de cellules par micromanipulation

1. Appliquez 2 ml de LB 1× dans un tube PCR stérile de 0,2 ml et incubez sur de la glace ou dans un refroidisseur PCR.
2. Fixez une capillaire en verre de 30 à 100 mm de diamètre aux micromanipulateurs. Le diamètre de la capillaire dépend de la taille des cellules abritant le symbiote bactérien cible.
3. Marquez la position correspondant à la profondeur d'un tube PCR de 0,2 ml sur une capillaire en verre de 15 mm de diamètre, et fixez-le à l'autre micromanipulateur.
Appliquez 50 ml de sol U, cinq à dix fois, sur la surface intérieure du couvercle.
5. Collectez les cellules de protistes hôtes.
6. Lavez les cellules plus de quatre fois.
Appliquez 50 ml de NP-40 à 1 % sur la face interne du couvercle d'une nouvelle boîte de Petri.
8. Collectez une seule cellule du protiste hôte avec une nouvelle capillaire.
9. Remplacez le couvercle de la boîte de Petri sur la scène par le couvercle avec 1 % de NP-40.
10. Trempez le bout de la capillaire de 15 mm de diamètre dans la goutte de 1 % NP-40 et ajustez la pression à l'intérieur de la capillaire en manipulant le Cell Tram Vario. Faites attention à ne pas expulser complètement le 1 % NP-40 à l'intérieur de la capillaire. Les bulles rendent l'image en contraste de phase floue.
11. Trempez le bout du capillaire de 30 à 100 mm de diamètre près du bout du capillaire de 15 mm de diamètre dans la goutte de 1 % de NP-40 et relâchez délicatement la cellule protiste hôte.
12. Collectez autant de cellules bactériennes que possible avec un capillaire de 15 mm de diamètre.
13. Libérez les cellules collectées dans le LB dans le tube PCR.

Amplification du génome entier

1. Incubez les cellules bactériennes collectées dans 1× LB sur de la glace ou dans un refroidisseur PCR pendant 10 minutes.
2. Préparez et effectuez la réaction de contrôle négatif en parallèle avec la réaction de l'échantillon.
Ajoutez 1,0 ml de NB et 22 ml de tampon d'échantillon, mélangez brièvement.
4. Préparez le mélange de réaction : mélangez 2,5 ml de solution enzymatique et 22,5 ml de tampon de réaction en pipetant.
5. Ajoutez le mélange de réaction au mélange d'échantillons.
Incuber à 30°C pendant 2,5 h.
7. Arrêtez la réaction en incubant à 65 °C pendant 10 minutes.
8. Vérifiez l'amplification par électrophorèse sur gel d'agarose.
9. Purifiez l'ADN par précipitation à l'éthanol.
Dissoudre le précipité dans 50 ml de TE.
11. Mesurer la concentration en ADN.

Vérification de la pureté de l'échantillon

1. Préparez une dilution de 1:200 de l'échantillon de WGA purifié dissous dans TE et de la réaction de contrôle négatif sans purification. Utilisez 1/10 du volume comme modèle pour le PCR suivant.
2. Réalisez une PCR en utilisant des jeux de primers spécifiques pour les gènes d'ARNr SSU eubactériens, archéens et eucaryotes, ainsi que ceux spécifiques aux gènes codant des protéines tels que hsp60 et gyrB. Effectuez toujours l'expérience de contrôle négatif pour la PCR. Conditions de PCR : 95°C 30 s, 25 cycles de (95°C 10 s, 50°C 30 s, 72°C 2 min), 72°C 4 min.
3. S'il n'y a pas d'amplification PCR à partir de l'échantillon de contrôle négatif, que ce soit pour la WGA ou la PCR, et que seules les PCR utilisant des amorces spécifiques aux bactéries génèrent des produits à partir de l'échantillon WGA, passez à l'étape suivante.
4. Effectuer une amplification PCR des gènes d'ARNr 16S eubactériens avec une ADN polymérase à correction d'erreurs.
5. Cloner et séquencer les produits de PCR avec des méthodes standard.
6. Vérifiez si les génomes des espèces bactériennes cibles prédominent dans l'échantillon et évaluez également les variations intra-espèces de la bactérie cible.

Séquençage du génome

Après le contrôle de pureté de l'échantillon WGA, préparez une bibliothèque pour le séquenceur Illumina.

Référence :

1. Hongoh Y, Toyoda A. Séquençage du génome entier d'une bactérie non cultivable à l'aide de l'amplification du génome entier[M]//Séquençage de nouvelle génération à haut débit. Humana Press, Totowa, NJ, 2011 : 25-33.